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導讀

乳酸菌是發酵糖類且主要產物為乳酸的一類無芽孢和革蘭染色陽性細菌的總稱，乳酸菌廣泛存在于自然界和人和動物的消化系統中，幾乎所有菌型都對人和動物無毒無害，可維護人和動物的身體健康。乳酸菌具備多種有益功能，其在醫藥、生物技術、食品和飼料等領域已得到廣泛應用。截至2010年，我國乳酸菌產業規模已經超過200億元，產量突破160萬t。在養殖業中，抗生素的使用日漸威脅人類健康和環境安全，世界各國已普遍禁用或限用飼用抗生素;此外，微生物飼料添加劑已經在畜禽養殖業中得到廣泛地認可和使用，其中最受推崇的微生物飼料添加劑之一就是乳酸菌。乳酸菌在動物體內能發揮許多生理功能，有促進動物生長，調節胃腸道正常菌群，維持微生態平衡及改善胃腸道的功能，可提高食物消化率和生物效價，降低血清膽固醇及控制內毒素，抑制腸道內腐敗菌生長，提高機體免疫力及防治多種腸道疾病。2008年12月中華人民共和國農業部1126號公告《飼料添加劑品種目錄(2008)》中規定可直接飼喂動物的飼料級微生物添加劑菌種:地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、兩歧雙歧桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、乳酸腸球菌、嗜酸性乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、產朊假絲酵母、釀酒酵母、沼澤紅假單胞菌和保加利亞乳桿菌，共16種，其中11種為乳酸菌。

盡管乳酸菌在養殖業中意義重大，但其作為生物飼料添加劑的規模還比較小，目前市場份額約為10億元，其主要原因在于目前乳酸菌的研究和應用更多地集中在發酵乳制品(益生菌酸奶、益生菌發酵乳飲料和益生菌奶酪)、發酵豆乳制品、功能性食品配料、食品添加劑(在嬰兒配方乳粉、中老年乳粉和果汁等中的添加等)和膳食補充劑(片劑和膠囊等)等方面上，研究方向更多地集中在發酵菌劑的研制和使用等。規模的局限也造成乳酸菌飼料添加劑研發滯后。要為消費者提供更多健康的肉類食品，就必須加快乳酸菌工業化生產的研究。目前乳酸菌飼料添加劑的規模化生產需要解決3個問題，原料廉價易得，最好是廢棄的農副產品;工藝低碳環保，盡量減少能源消耗和二次污染;操作簡便，不需添加外源物質，如都符合就能生產出高密度的乳酸菌，為此研究者們不懈努力。劉曉紅等以玉米粉和麥麩等為固態基質，對一株植物乳桿菌進行固態混合發酵試驗，培養結束后乳桿菌活菌數可達100億CFU/g;方芳等以玉米粉、豆粕和麥麩為基質對保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌進行固態混合發酵試驗，40℃時得出最好發酵結果，各活菌數超過10億CFU/mL。許贛榮等明一種利用糖渣培養乳酸菌及生產乳酸活菌飼料的方法，以玉米淀粉制糖工業副產物糖渣為主要原料，添加麩皮和蛋白胨等物質，采用固態分批液態分批或液態補料的方式，研制出液態培養活菌含量超過10億CFU/mL，固態培養活菌含量超過10億CFU/g的乳酸菌劑。然而對照規?；a需要解決的3個問題，上述研究離目標要求還有一定距離。在我國，每年都有數以萬t的菠蘿渣、羅漢果渣、燒仙草渣、馬蹄淀粉廢水及馬蹄渣等農產品加工廢渣，量大且相對集中，對其進行資源化利用的意義十分重大。研究植物乳桿菌對上述農副產品廢渣的利用情況，同時發現一種利用馬蹄淀粉廢水及馬蹄渣生產乳酸菌飼料添加劑的新方法。

1材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌種

植物乳桿菌，實驗室分離保存，標記為LP199，菌劑為干粉狀，活菌含量400B/g。

1. 1. 2 農副產品廢渣

菠蘿渣(菠蘿經壓榨機壓榨取汁后的果渣)，羅漢果渣(鮮羅漢果經浸提壓榨后的果渣，主要為羅漢果核)，燒仙草渣(燒仙草干草經浸提后的草渣)，馬蹄淀粉廢水(馬蹄經勻漿、去渣和流槽沉淀后的廢水)，馬蹄渣(馬蹄勻漿經漿渣分離再作壓濾后之渣)。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 可資源化利用農副產品廢渣的快速篩選

取0.40 g 植物乳桿菌菌劑，加入至1 000 mL滅菌氯化鈉注射液中，混勻，制得1億CFU/mL 的菌種液。將菌種液按1∶10 分別接種于下列試驗編號的樣品中。

1 號: 450 g 菠蘿渣，加入450 mL 蒸餾水，置于1 000 mL廣口瓶中; 2 號: 450 g 羅漢果渣， 加入450 mL 蒸餾水， 均質， 置于1 000 mL廣口瓶中; 3 號: 450g 燒仙草渣，加入450mL 蒸餾水，均質，置于1 000 mL 廣口瓶中; 4 號: 900 mL 馬蹄淀粉廢水， 置于1 000mL廣口瓶中; 5 號: 450 g 馬蹄渣，加入450mL 蒸餾水，置于1 000mL廣口瓶中。密封置30 ℃發酵24 h，進行感官、菌相鏡檢及pH 測定，其中pH 用檢定合格的pH 計測定。5個樣品同時另備一份，相應編號為A、B、C、D 和E，進行發酵前的感官、菌相鏡檢及pH 測定。選取發酵后色澤和氣味較好、革蘭陽性短桿菌較多且純及pH 較低的樣品作為植物乳桿菌可資源化利用的基質。

1. 2. 2 植物乳桿菌LP199 對選用基質營養成分利用的試驗

對篩選出的基質，重復1.2.1 中試驗，檢測其發酵前后的總糖、蛋白質、總酸( 以乳酸計) 、乳酸、脂肪、淀粉、粗纖維和膳食纖維等營養成分，并分析前后變化。相關方法根據國家標準GB /T5009.8—2008、GB 5009.5—2010、GB/T 12456—2008、SN/T 2007—2007、GB/T 5009.6—2003、GB/T 5009.9—2008、GB/T 5009.10—2003 及GB/T 5009.88—2008進行。對固體廢渣進行氨基酸檢測，分析發酵前后變化。對氨基酸的檢測按國家標準GB /T5009.124-2003方法進行。

1.2.3 選擇基質生產乳酸菌劑的試驗

試驗前，現場取樣，測可溶性固形物、pH、鏡檢和菌落總數。可溶性固形物用手持式折光儀直接讀數，菌落總數按國家標準GB 4789.2—2010方法檢測。試驗時，將植物乳桿菌菌種液按1∶10 直接接入基質中過夜進行一級放大，再按同比例接種培養，發酵24 h，測鏡檢、感官、pH 及乳桿菌數，同時作對照試驗。

2結果與分析

2. 1 可資源化利用的農副產品廢渣快速篩選結果

利用植物乳桿菌LP199 對菠蘿渣、羅漢果渣、燒仙草渣、馬蹄淀粉廢水及馬蹄渣等進行發酵試驗，結果見表1。

試驗所用菌種LP199，為一種植物乳桿菌，系革蘭陽性桿菌，分散排列，菌體大小( 0. 8～1. 0) μm×( 1. 0～2.0) μm。菌種LP1999 在菠蘿渣中未能占據主導地位，大量生長的是一種革蘭陽性鏈桿菌; 羅漢果渣發酵后總體菌量較少，并且酵液發臭; 燒仙草渣接種培養后呈現混合菌相，pH 未能明顯下降，且出現產氣和腐爛味; 因此上述3 種廢渣均不適合作為生產乳酸菌劑的基質。馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣發酵后，其pH 迅速下降，具有特殊發酵的酸香味，菌體主要為植物乳桿菌，故研究首先選取此2 種物質作為培養植物乳桿菌的基質。

2. 2 植物乳桿菌LP199 對馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣營養成分的利用結果

將菌種LP199 接種于馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣中，檢測其發酵前后總糖、蛋白質及總酸等營養成分含量，結果見表2。

發酵后，馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣總糖接近0，而總酸大幅增加。總酸成分主要為乳酸，馬蹄淀粉廢水中乳酸與總酸的比為82%，馬蹄渣中乳酸與總酸的比為98%，說明菌種LP199 是同型乳酸發酵，如此高質量分數的乳酸足以抑制或殺滅其他細菌，為其免于對基質的熱處理從而實現低碳發酵奠定基礎。

發酵前后，蛋白質、脂肪和淀粉的含量沒有明顯變化，提示菌種LP199 與其他大多數乳酸菌一樣，缺乏這些物質的分解酶系，其生長所需因子主要來源于馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣中已有的營養物質，同時也說明馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣的利用前景廣闊。試驗同時檢測的還有馬蹄渣發酵前后氨基酸的含量，結果見表3。

馬蹄渣經菌種LP199 發酵后，其氨基酸含量由4.400 g /100 g 增加至5.743 g /100 g，總量增加30. 50%。氨基酸中，只有胱氨酸減少，其余全部增加，增加超過50%的有谷氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸，其中后5 種氨基酸為畜禽必需氨基酸。氨基酸含量的變化反映出菌種LP199 復雜的生理代謝作用，因為氨基酸本身就是乳酸菌的良好底物，所以發酵后氨基酸含量的增加可能來源于菌體的增加，表明菌種LP199 是一種優良的單細胞蛋白。

2.3 馬蹄淀粉廢水及馬蹄渣生產乳酸菌劑試驗結果

將菌種放大一級后再分別接種于馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣中，自然環境條件下密封放置，試驗結果見表4。試驗于2012 年12 月23 日和2013 年2 月1 日在宏源公司生產現場進行2 次，日平均氣溫20 ℃ ～15 ℃，結果取2 次試驗數據的平均數。

從表4 可見: 馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣基質中，含有一定的雜菌，數量超過100 萬CFU/( mL·g-1) ，主要是一些革蘭陽性小球菌， 如不接種菌種LP199，24 h 后，該菌會大量繁殖，菌體密度超過10 億CFU/( mL· g-1) 。而接入10% 的菌種LP199 一級放大菌液后，菌種LP199 的生長數量居于主導地位，培養液中幾乎全為植物乳桿菌，由于沒有其他外源菌，表中乳桿菌的數量就是菌種LP199 的數量，它在馬蹄淀粉廢水中的純度是91. 70%，在馬蹄渣中的純度幾乎是100%，而且密度較高，活菌數超過10億CFU/(mL·g-1)。

目前由于我國還沒有乳酸菌菌劑的國家或行業標準，如以中華人民共和國農業部光合細菌菌劑的標準作為生物菌劑的判定依據，可發現試驗得到的乳酸菌菌劑數量的雜菌率均滿足其要求，是一種優良的生物飼料添加劑，特別是馬蹄渣中還含有大量的膳食纖維(見表2)，更凸顯其作為飼料添加劑的優越性。

3討論

研究發現一種利用馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣生產植物乳桿菌飼料添加劑的新方法，該方法具有原料廉價易得、工藝低碳環保和操作簡便可行等特點，由此生產的生物飼料添加劑可廣泛應用于畜禽和水產養殖。

植物乳桿菌屬于乳桿菌屬，其營養要求比較復雜，需要氨基酸、核酸衍生物、維生素和可發酵的糖等，因此并非所有的農副產品廢渣都可被其利用，如菠蘿渣、羅漢果渣和燒仙草渣等，廢棄柑橘和柿子則更難被利用。研究發現，馬蹄淀粉廢渣是培養植物乳桿菌LP199 的優良基質。馬蹄淀粉加工過程中產生的廢水和廢渣， 可溶性固形物達1.50%～2.00%，實際上可看作是馬蹄勻漿的上清液( 因廢渣含水量也達到79.60%) ，其中蘊含著豐富的營養物質，非常適合植物乳桿菌的生長，植物乳桿菌接種至馬蹄淀粉的廢水和廢渣后，能迅速增殖，產生大量的乳酸，pH 低于4.0，抑制和殺滅其他微生物，使雜菌率控制在10%以內，這一培養特性可用于生物飼料添加劑的工業化生產，因其不需添加任何外源物質，不需任何熱處理措施，甚至可做到0排放。

與馬蹄淀粉廢水相比，馬蹄渣作為基質更有利于植物乳桿菌LP199 的增殖，利用后不僅活菌含量更高，且菌物更純，純度幾乎可達100%。有趣的是，馬蹄渣接種植物乳桿菌LP199培養后，其氨基酸含量增加30. 50%，這可能是由于菌體蛋白的增加造成的，這一結果表明菌體本身可作為高質量的單細胞蛋白。然而由于氨基酸的總含量不高，因此其應用意義更多地在植物乳桿菌的大量增殖足以達到發揮對動物的益生作用，同時通過改善馬蹄渣的營養成分，增加其適口性，從而增加其作為生物飼料添加劑的性價比。

采用一級放大，二級10%的接種量，自然環境條件下直接培養，無需任何特殊的工藝，即可將馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣變為活菌含量超過10億CFU/(mL·g-1)的乳酸菌飼料添加劑。由于乳酸菌對環境敏感，不易保存，因此還需對其活性保存條件作進一步研究。

以年產2 000 t 馬蹄淀粉來計，馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣量將分別約達到1.20 萬和0.45 萬t，其量大，且相對集中，因此對其進行資源化利用生產乳酸菌飼料添加劑前景廣闊，馬蹄濕渣中還含有13.50 g /100 g 的膳食纖維，折合干物質基礎含量為67.60 g /100 g，這將大幅增加其作為生物飼料添加劑的潛在價值。