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1.1 菌種與培養(yǎng)基

發(fā)酵菌種:本試驗所用菌種均為購買或獲贈于其他實驗室，共12株，包含曲霉菌3株，木霉菌2株，枯草芽孢桿菌4 株，酵母菌3 株。菌種保存在4 ℃冰箱，每3 個月活化1 次。

發(fā)酵培養(yǎng)基:甘薯渣和菜籽粕按9∶ 1 混勻，30 g裝入250 mL 廣口瓶，121℃滅菌20 min。甘薯渣購于綿陽一淀粉加工廠，為提取淀粉后的殘渣，粗蛋白質(zhì)含量為1.76% ，粗纖維含量為8.80% ;菜籽粕購于四川省雅安市農(nóng)牧市場，粗蛋白質(zhì)含量為36.93% ，粗纖維含量為12. 27%。

1.2 最適單菌種的篩選及菌種復(fù)配篩選

采用單因子試驗設(shè)計，4 類共12 株菌種分別接種于甘薯渣發(fā)酵培養(yǎng)基進行單菌發(fā)酵。發(fā)酵條件為接種量1 × 10⁶ 個/g，加水60% ，溫度30 ℃，發(fā)酵4d，pH 自然，每株菌重復(fù)3 次，以未添加菌液的空白發(fā)酵組為對照。考察發(fā)酵前后粗蛋白質(zhì)含量、羧甲基纖維素酶( carboxymethyl cellulose，CMCase) 活性和還原糖含量變化，從曲霉類、木霉類、芽孢桿菌類、酵母類菌株中，各篩選1 株最適發(fā)酵菌種，并以篩選出的4 株菌中發(fā)酵效果最好的菌種作為主菌種(A) ，分別和其他的3 株輔發(fā)酵菌種(B、C、D) 進行雙菌、三菌和四菌混菌復(fù)配篩選。各菌種的接種比例為1∶ 1 (1∶ 1∶ 1、1∶ 1∶ 1∶1) ，每組均設(shè)3 個重復(fù)。發(fā)酵條件參考主發(fā)酵菌單因素發(fā)酵優(yōu)化試驗結(jié)果:接種量1 × 10⁶ 個/g，發(fā)酵時間4 d，料水比(m/V) 1∶ 1. 3，培養(yǎng)溫度38 ℃。最終以粗蛋白質(zhì)含量為主要指標(biāo)，CMCase 活性和還原糖為輔助指標(biāo)，確定最優(yōu)的菌種組合。

1.3 正交試驗優(yōu)發(fā)混菌發(fā)酵條件

采用正交設(shè)計進一步對發(fā)酵溫度( A)、發(fā)酵時間(B)、料水比(C)、接種量(D)、菌種復(fù)配比例(E) 進行5 因素4 水平的發(fā)酵條件優(yōu)化( n = 3)。其中接種量、發(fā)酵時間、料水比、發(fā)酵溫度水平設(shè)置參考主發(fā)酵菌單因素發(fā)酵條件優(yōu)化試驗結(jié)果。發(fā)酵結(jié)束后，取部分鮮樣測定CMCase 活性，剩余部分65 ℃烘干，粉碎過40 目篩，用于測定粗蛋白質(zhì)和還原糖含量。

1.4 最優(yōu)發(fā)酵條件發(fā)酵對甘薯渣營養(yǎng)價值的影響

根據(jù)正交試驗設(shè)計優(yōu)化出的混菌發(fā)酵參數(shù)，對甘薯渣進行固態(tài)發(fā)酵，設(shè)置1 個對照組( 不接種菌種)，其他條件與試驗組一致。每組設(shè)3 個重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后，取部分鮮樣測定CMCase、濾紙酶( filterpaper，F(xiàn)PA)、β－葡萄糖苷酶(β-glucosidase)、淀粉酶活性，剩余部分65 ℃烘干，粉碎過40 目篩，用于測定干物質(zhì)、粗灰分、粗纖維、粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、還原糖含量。

1.5 指標(biāo)測定

還原糖含量測定參照黃曉鈺等《食品化學(xué)綜合實驗》;水分、粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、粗灰分、粗纖維含量的測定參照張麗英《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》; 纖維素酶活性參照國標(biāo)GB /T23881—2009、何鳳琴等及湯小朋等的測定方法;淀粉酶活性參照陳毓荃主編的《生物化學(xué)實驗方法和技術(shù)》中介紹的淀粉酶活性的測定方法。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)先用Excel 2003 進行整理，再用SPSS21. 0 處理、分析。單因素篩選試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析并結(jié)合Duncan 氏法進行多重比較;正交試驗數(shù)據(jù)進行極差分析及方差分析。所有試驗結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著水平為P ＜0.05。

2.1 最適單菌種發(fā)酵的篩選

12 種單菌種發(fā)酵甘薯渣后，粗蛋白質(zhì)含量、CMCase 活性、還原糖含量見表1。從表中可以看出，黑曲霉2 發(fā)酵甘薯渣后其粗蛋白質(zhì)含量從5.64%提高到7.89% ，提高了44.7% ，顯著高于其他菌種發(fā)酵組(P＜0.05) ;黑曲霉2發(fā)酵組所產(chǎn)的CMCase 活性為2.61 U /g，顯著高于其他單菌發(fā)酵組(P＜0.05)。綜合考慮粗蛋白質(zhì)含量、CMCase活性和還原糖含量等指標(biāo)，確定黑曲霉2為曲霉組中優(yōu)勢菌種，同時也是12種菌株中最優(yōu)發(fā)酵菌種，將其定為本試驗主發(fā)酵菌種，記作A。

不同的微生物產(chǎn)酶的種類和產(chǎn)酶能力不同，需要根據(jù)發(fā)酵目的不同來選擇不同的微生物進行發(fā)酵。本研究一共對4類共12種菌株進行發(fā)酵篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)曲霉中的黑曲霉2，木霉中的里氏木霉，芽孢桿菌枯草芽孢桿菌1，酵母中的釀酒酵母1效果較好。其中黑曲霉能產(chǎn)生淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、葡萄糖酶、植酸酶、半乳甘露聚糖酶等酶類，因此在發(fā)酵中得到廣泛的應(yīng)用，但黑曲霉因變異性大，不同的黑曲霉菌株，發(fā)酵效果不一樣。木霉也廣泛用于微生物發(fā)酵，資料報道里氏木霉能分泌大量的纖維素酶和木聚糖酶。芽孢桿菌作為益生菌，可促進動物對飼料的消化、吸收、利用，從而提高飼料的轉(zhuǎn)化率，并在防病促生長中起到非常重要作用。酵母屬于益生菌，在發(fā)酵中應(yīng)用廣泛，發(fā)酵過程中酵母自身的繁殖生長會產(chǎn)生大量的高營養(yǎng)價值菌體蛋白。

以篩選出的黑曲霉2為主發(fā)酵菌，與篩選出的其他3種菌種進行不同復(fù)配，發(fā)現(xiàn)四菌組合發(fā)酵效果優(yōu)于雙菌和三菌組合，發(fā)酵后甘薯渣粗蛋白質(zhì)含量和CMCase酶活均高于其他組合(表2)。有研究報道，里氏木霉與黑曲霉混合發(fā)酵可彌補里氏木霉所產(chǎn)的β－葡萄糖苷酶活性較低的不足，提高酶解效率，讓基質(zhì)充分發(fā)酵。Ahamed等對里氏木霉ＲUT－C30與黑曲霉LMA進行混合發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)FPA可達到7.1U/mL，與單菌發(fā)酵的3.4U/mL相比提高了108.8%。本研究發(fā)現(xiàn)4菌混合發(fā)酵，效果優(yōu)于其他發(fā)酵組合，可能原因在于多菌組合發(fā)揮了各個菌種相互之間的協(xié)同效應(yīng)。

微生物接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、水分含量等因素也對發(fā)酵效果有著重要的影響。本研究利用L₁₆(4⁵)正交試驗設(shè)計考察了4菌混合發(fā)酵的最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)，試驗獲得的混菌發(fā)酵最適參數(shù)為:培養(yǎng)溫度38℃，培養(yǎng)時間4.5d，料水比1∶1.3，接種量1×10⁶個/g，接種比例1∶1∶2∶1。傅婭梅對復(fù)合蛋白質(zhì)飼料適宜的發(fā)酵參數(shù)進行探討，發(fā)現(xiàn)最適參數(shù)為:發(fā)酵時間2.5d，加水量65%，接種量10%，枯草芽孢桿菌:產(chǎn)朊假絲酵母:植物乳酸桿菌為1∶1∶1;胡瑞等用復(fù)合益生菌發(fā)酵豆粕，發(fā)現(xiàn)在復(fù)合益生菌(釀酒酵母∶米曲霉∶枯草芽孢桿菌=5∶1∶2)總添加量0.5%，料水比1∶0.4，發(fā)酵48h小效果最佳。

陳松等利用產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉、枯草芽孢桿菌和黑曲霉混菌發(fā)酵蘋果渣，發(fā)酵后基質(zhì)粗蛋白質(zhì)含量較發(fā)酵前提高了108%。王叔軍等向甘薯渣中添加少量的麩皮和尿素作為氮源，用微生物進行混菌發(fā)酵后，粗蛋白質(zhì)含量提高到42.4%。趙啟美等采用固液結(jié)合的方法，發(fā)酵甘薯渣后，粗蛋白質(zhì)含量提高了58.4%;粗纖維含量由25.3%下降到14.2%。本研究中，發(fā)酵后產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和灰分含量顯著提高。但發(fā)酵后粗纖維含量沒有下降，反而有所上升，可能原因在于甘薯渣在提取淀粉過程中，因淀粉提取程度不同，造成甘薯渣粗纖維含量差異很大，本研究中所用原料粗纖維只有8.8%，低于資料報道的27%的水平。因此發(fā)酵時微生物優(yōu)先利用淀粉生長，這也是本研究中甘薯渣發(fā)酵后與湯小鵬等發(fā)酵木薯渣相比，本試驗中產(chǎn)物中淀粉酶活性高，而CMCase等纖維素降解酶活性相對較低的原因。多菌混菌固態(tài)發(fā)酵，可有效提高產(chǎn)物中FPA、CMCase和淀粉酶等活性，本研究采用4種不同菌株混菌發(fā)酵，產(chǎn)物中檢測出了FPA、CMCase、β－葡萄糖苷酶和淀粉酶等活性。微生物在發(fā)酵過程中，利用發(fā)酵底物提供的氮源和碳源進行繁殖、生長，消耗部分底物，導(dǎo)致底物干物質(zhì)含量降低，從而使粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分含量相對提高，但是通過微生物發(fā)酵，一方面微生物可將甘薯渣中低質(zhì)量蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為高質(zhì)量菌體蛋白，提高蛋白質(zhì)質(zhì)量;另一方面固態(tài)發(fā)酵后產(chǎn)生的各種酶，以及微生物發(fā)酵過程中累積大量營養(yǎng)豐富的菌體蛋白及許多微生物代謝產(chǎn)物，間接提高了發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)價值，可望使甘薯渣營養(yǎng)價值得到進一步改善。此外，混菌發(fā)酵時有益微生物的競爭性生長，可望有效抑制導(dǎo)致甘薯渣腐爛變質(zhì)的有害微生物如黑根霉(Rhizopus stolonifer)軟腐菌生長，提高甘薯渣的存儲價值。

①通過L₁₆(4⁵)正交試驗得到多菌混合發(fā)酵甘薯渣的最優(yōu)條件為:發(fā)酵溫度38℃，發(fā)酵時間4.5d，料水比1∶1.3，接種量1×10⁶個/g，接種比例為黑曲霉2∶里氏木霉∶枯草芽孢桿菌1∶釀酒酵母1=1∶1∶2∶1。

②以最優(yōu)條件混菌發(fā)酵甘薯渣后，發(fā)酵產(chǎn)物中可檢測到CMCase、FPA、β－葡萄糖苷酶和淀粉酶等酶活性。與對照相比，以干物質(zhì)為基礎(chǔ)，發(fā)酵后顯著提高了產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和還原糖含量。發(fā)酵后粗纖維含量沒有下降，反而有所上升。