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導(dǎo)讀

　　仔豬斷奶后，生長發(fā)育快，但消化道發(fā)育不全，免疫力低，易造成厭食、下痢、生長停滯、失重甚至死亡。乳酸菌飼料制劑具有維護動物腸道健康、緩解不良應(yīng)激、調(diào)節(jié)機體代謝和改善畜產(chǎn)品品質(zhì)的功能，是我國2008年批準(zhǔn)使用的飼料添加劑。但由于乳酸菌飼料制劑生產(chǎn)工藝不完善，尤其是干燥技術(shù)，乳酸菌制成粉末制劑后大量失活，應(yīng)用效果不好，一直未得到大規(guī)模應(yīng)用。乳酸菌活菌制劑的干燥技術(shù)主要有冷凍干燥技術(shù)、噴霧干燥技術(shù)、真空干燥和流化床干燥技術(shù)。目前市場上常見的乳酸菌菌粉是通過冷凍干燥制備而成，但是冷凍干燥存在生產(chǎn)不連續(xù)、成本較高、周期較長、耗能大等問題。相比于冷凍干燥，噴霧干燥具有可連續(xù)生產(chǎn)、成本較低、高效等特點；但由于噴霧干燥技術(shù)采用高溫氣化干燥，對不耐熱的菌株破壞較大。課題組前期通過紫外誘變和高溫馴化獲得一株耐消化、耐高溫的嗜酸乳桿菌菌株，將其發(fā)酵液通過噴霧干燥技術(shù)降低水分含量，并通過噴霧干燥工藝優(yōu)化提高其存活率，可在降低成本的前提下，保證其應(yīng)用效能。

　　因此，本研究在此基礎(chǔ)上進一步通過單因素實驗篩選乳酸菌制劑的最優(yōu)包埋壁材；并通過正交實驗優(yōu)化噴霧干燥工藝；然后對乳酸菌制劑微膠囊的外觀結(jié)構(gòu)、包埋率和穩(wěn)定性進行評估；最后以斷奶仔豬實驗考察乳酸菌制劑的應(yīng)用效果。

　　1材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌種

　　嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophillus)FZU-LA1301X，課題組前期篩選保存。

　　1.1.2 培養(yǎng)基

　　MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，牛肉膏10.0 g，葡萄糖20.0 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，吐溫80 0.1 mL，七水硫酸鎂0.58 g，四水硫酸錳0.025 g，蒸餾水1 000 mL。121℃滅菌20 min。

　　MRS固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5％的瓊脂。

　　1.1.3 乳酸茵飼料制劑微膠囊壁材的選擇

　　1.1.3.1 微膠囊壁材及濃度的選擇

　　以阿拉伯膠、明膠、β-環(huán)糊精、麥芽糊精和可溶性淀粉5種不同材料作為壁材，分別配置質(zhì)量分數(shù)為10％，15％和20％的溶液，使用均質(zhì)機在10 000 r/min速率下均質(zhì)3 min，形成穩(wěn)定、均勻且流動性好的壁材溶液。通過測定噴霧干燥后菌粉中的活菌數(shù)，選擇較優(yōu)的壁材及濃度。

　　1.1.3.2 嗜酸乳桿菌微膠囊的制備

　　將壁材溶液在室溫下與等體積的嗜酸乳桿菌菌懸液(濃度約為4.50×108CFU/mL)}昆合，充分攪拌混合后在進口溫度160℃、進料速率500 mL/h的條件下進行噴霧干燥制備嗜酸乳桿菌微膠囊，然后根據(jù)各壁材在噴霧干燥過程中的性狀表現(xiàn)選取最佳壁材。

　　1.2 方法

　　1.2.1 正交實驗優(yōu)化噴霧干燥工藝

　　乳酸菌制劑噴霧干燥過程是先將乳酸菌菌懸液與壁材溶液混合形成均勻的料液，然后料液經(jīng)蠕動泵進入噴霧干燥霧化器形成細小的霧滴，再與高溫的熱空氣接觸，在極短的時間內(nèi)蒸發(fā)水分，經(jīng)過旋風(fēng)分離器，最后得到乳酸菌菌粉。由于噴霧干燥工藝條件如進口溫度、進料速率和壁材比例等，會對菌粉中的活菌數(shù)產(chǎn)生直接影響，所以通過單因素實驗和正交實驗對各工藝條件進行優(yōu)化。實驗中選擇了L9(34)正交表。4個因素為A進口溫度、B進料速率、C壁材比例(阿拉伯膠：麥芽糊精)和D壁材濃度，詳見表1。

　　1.2.2 微膠囊包埋率和穩(wěn)定性測定

　　包埋率是指微膠囊中的活菌數(shù)與產(chǎn)品中的活菌數(shù)的比值。采用低溫高速離心機在4℃，1 000 r/min速率下離心20 min，離心沉淀微膠囊，未被包埋的菌體處于上清液中，然后通過涂布培養(yǎng)法，分別測定產(chǎn)品中的總活菌數(shù)和沉淀中的活菌數(shù)，來計算包埋率。

　　穩(wěn)定性是含活菌制劑微膠囊質(zhì)量評價的重要指標(biāo)，為評價微膠囊的貨架穩(wěn)定性，將噴霧后的微膠囊分別置于室溫(25℃)和4℃條件下貯藏90 d，并定期測定其活菌數(shù)。

　　1.2.3 微膠囊產(chǎn)品的外觀測定

　　利用Phenom G2 pro飛納臺式掃描電子顯微鏡對微膠囊產(chǎn)品的外觀進行表征。

　　1.2.4 動物實驗

　　1.2.4.1 斷奶仔豬生長性能測定

　　300只斷奶仔豬(3周齡)分成2組(每組150只)：一組對照組，喂食基礎(chǔ)日糧；一組乳酸菌組，在基礎(chǔ)Et糧中添加100 g/t噴霧干燥乳酸菌粉(活菌數(shù)為8.70 LogCFU/g)，試驗期30 d。試驗期間觀測試驗動物的生長性能，包括：平均日增重、平均日采食量、料重比、腹瀉率和死亡率。

　　1.2.4.2 斷奶仔豬糞便樣品微生物測定

　　試驗結(jié)束時，各組隨機采集新鮮糞便樣品，分別用MRS培養(yǎng)基和伊紅美藍培養(yǎng)基通過涂布培養(yǎng)法測定其中的乳酸菌及大腸桿菌的活菌數(shù)。

　　2結(jié)果與討論

　　2.1 乳酸菌飼料制劑噴霧干燥壁材的選擇

　　2.1.1 微膠囊壁材的選擇

　　在微膠囊的制備中，壁材特性是影響微膠囊特性至關(guān)重要的因素，理想的壁材具有高度溶解性、無毒無害、優(yōu)良的乳化性質(zhì)、成膜性好、溶液黏度低及成本低廉等優(yōu)點。本實驗選取阿拉伯膠、麥芽糊精、可溶性淀粉、β-環(huán)糊精和明膠5種常用微生物微膠囊壁材進行噴霧干燥制備乳酸菌飼料制劑。在噴霧干燥過程中發(fā)現(xiàn)，明膠在常溫時易凝結(jié)成膠狀，無法形成流動性好的體系，而β-環(huán)糊精在較高濃度時會呈現(xiàn)顆粒狀，較難形成均勻的體系，不利于之后的噴霧干燥，且在噴霧干燥過程中，微膠囊產(chǎn)品可能會在噴霧干燥塔的塔壁上停留而導(dǎo)致活菌數(shù)下降，所以本課題選擇黏度較低，分散均勻的阿拉伯膠、麥芽糊精、可溶性淀粉作為主要的壁材進行研究。

　　2.1.2 壁材濃度及組合比例的優(yōu)化

　　2.1.2.1 壁材濃度的優(yōu)化

　　在確定阿拉伯膠、麥芽糊精和可溶性淀粉作為噴霧干燥的壁材后，在進口溫度160℃，進料速率500 mL/h條件下，以活菌數(shù)為指標(biāo)通過單因素實驗篩選壁材的最佳濃度，結(jié)果見圖1。由圖1可知，阿拉伯膠和可溶性淀粉在15％時具有較好的噴霧效果，麥芽糊精在15％、20％和25％時活菌數(shù)差異不大；且阿拉伯膠比麥芽糊精和可溶性淀粉具有較好的保護效果。

　　2.1.2.2 壁材組合及組合比例的優(yōu)化

　　將阿拉伯膠、麥芽糊精和可溶性淀粉按1：1的比例兩兩組合，配置濃度為15％的壁材溶液，與等體積的嗜酸乳桿菌菌懸液混合，在進口溫度160℃、進料速率500 mL/h的條件下進行噴霧干燥，并以產(chǎn)品的活菌數(shù)為指標(biāo)，篩選最佳壁材組合，結(jié)果見圖2。阿拉伯膠/麥芽糊精組合的保護效果最好，產(chǎn)品的活菌數(shù)為8.54 LogCFU/g。

　　將阿拉伯膠、麥芽糊精按1：7、1：8、1：9和1：10的比例混合，配置質(zhì)量分數(shù)為15％的壁材溶液，與等體積的嗜酸乳桿菌菌懸液混合，在進口溫度160℃、進料速率500 mL/h的條件下進行噴霧干燥，并以產(chǎn)品的活菌數(shù)為指標(biāo)，篩選最佳壁材配比濃度，結(jié)果見圖3?？梢园l(fā)現(xiàn)，當(dāng)阿拉伯膠：麥芽糊精=1：7時噴霧效果最好，活菌數(shù)為8.62 LogCFU/g；但四種組合比例的活菌數(shù)差異并不顯著。

　　2.2 乳酸菌飼料制劑噴霧干燥條件的優(yōu)化

　　在噴霧干燥過程中，除了壁材種類、濃度和組合比例會影響噴霧效果，噴霧干燥的工藝條件也是重要的影響因素。本實驗以嗜酸乳桿菌活菌數(shù)為指標(biāo)，通過正交實驗來確定最佳的進口溫度、進料速率、壁材組合比例和壁材濃度，結(jié)果見表2。

　　由表2可知，極差R的排列順序為：進口溫度、壁材濃度、進料速率、壁材組合比例。經(jīng)分析。最佳噴霧條件為A1D2B1C3，即進口溫度160℃、壁材質(zhì)量分數(shù)20％，進料速率400 mL/h和壁材比例1：9，對A1D2B1C3組合進行驗證實驗，噴霧后活菌數(shù)為8.70 LogCFU/g。

　　2.3 乳酸茵飼料制劑微膠囊品質(zhì)評估

　　2.3.1 微膠囊外部結(jié)構(gòu)

　　采用掃描電鏡對乳酸菌飼料制劑微膠囊產(chǎn)品進行形態(tài)觀察，結(jié)果如圖4所示。微膠囊多為球形或橢圓球形，直徑約為5μm，表面可能由于干燥時高溫脫水導(dǎo)致凹凸不平。

　　2.3.2 微膠囊包埋率

　　微膠囊的包埋率是評價微膠囊質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，通過1.2.2中的方法計算噴霧干燥后微膠囊的包埋率。實驗中得到的微膠囊平均包埋率為72.8％。

　　2.3.3 微膠囊穩(wěn)定性

　　將噴霧干燥制備的微膠囊分別置于常溫(約25℃)和4℃條件下貯藏，并定期測定其活菌數(shù)，結(jié)果如圖5所示。由圖可知，無論是在4。C還是常溫保存，嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)都呈下降趨勢。4℃貯藏時下降較緩，第45 d活菌數(shù)為7.0 LogCFU/g，第90 d時活菌數(shù)為6.23 Log CFU/g；而常溫下貯藏15 d活菌數(shù)大約下降一個數(shù)量級，第30 d時活菌數(shù)為6.08 LogCFU/g

　　2.4 動物實驗評估乳酸菌飼料制劑的應(yīng)用效果

　　通過斷奶仔豬動物實驗評估乳酸菌飼料制劑的應(yīng)用效果，結(jié)果見表3。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)30 d喂食，實驗組仔豬的日均增重顯著高于對照組(P<0.05)；在腹瀉率和死亡率方面，與對照組相比，實驗組的腹瀉率和死亡率分別下降57.55％和40.03％，可見在飼料中添加乳酸菌可以促進仔豬生長，防治仔豬腹瀉，降低斷奶仔豬的死亡率。

　　Davis等認為在飼料中添加乳酸菌能改變動物消化道的菌群組成。乳酸菌能夠通過產(chǎn)酸降低腸道的pH值，促進蛋白酶等消化酶的分泌，有利于機體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而促進機體生長。張乃鋒等發(fā)現(xiàn)在飼料中添加植物乳桿菌能顯著提高生長豬的生長性能；肖宏德等在斷奶仔豬的日糧中添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌復(fù)配而成的益生菌制劑代替抗生素，發(fā)現(xiàn)能達到與抗生素持平的促生長效果。

　　乳酸菌與大腸桿菌的數(shù)量比值被認為是評價動物消化道微生物平衡的重要標(biāo)志，乳酸菌產(chǎn)生的有機酸能降低腸道pH值，抑制大腸桿菌等腸道病原菌的生長。索成等給斷奶仔豬喂食添加了植物乳桿菌ZF316的日糧后，發(fā)現(xiàn)增加了仔豬消化道中的乳酸菌數(shù)量，且降低了大腸桿菌的數(shù)量，與本實驗結(jié)果相符合。

　　乳酸菌制劑對斷奶仔豬糞便乳酸菌和大腸桿菌的影響如表4所示。與對照組相比，實驗組的仔豬糞便中乳酸菌數(shù)量顯著高于對照組，而大腸桿菌數(shù)量低于對照組。

　　3結(jié)論

　　本研究利用課題組前期開發(fā)的耐消化、耐高溫的嗜酸乳桿菌菌株，通過噴霧干燥技術(shù)開發(fā)低成本的高穩(wěn)定性乳酸菌飼料制劑，以期將其運用于斷奶仔豬的飼養(yǎng)，以降低仔豬在斷奶后的腹瀉率和死亡率。通過單因素實驗和正交實驗確定了乳酸菌飼料制劑的最佳制備條件為：以質(zhì)量分數(shù)為20％的阿拉伯膠和麥芽糊精按1：9的比例混合作為壁材，在進口溫度160℃，進料速率400 mL/h條件下進行噴霧干燥。最終的微膠囊產(chǎn)品的嗜酸乳桿菌活菌數(shù)為8.69 LogCFU/g；顆粒直徑約5txm，包埋率為72.8％；在25℃室溫下貯藏30 d，嗜酸乳桿菌活菌數(shù)為6.08 LogCFU/g。通過斷奶仔豬動物實驗評估產(chǎn)品的應(yīng)用效果發(fā)現(xiàn)，該產(chǎn)品能有效地促進仔豬生長，降低仔豬的腹瀉率和死亡率；并且仔豬糞便中的乳酸菌與大腸桿菌的比值明顯高于對照組。

　　因此，整體而言，該乳酸菌飼料制劑具有較好的常溫穩(wěn)定性，且應(yīng)用效果突出，具有替代傳統(tǒng)酸化劑的潛力，市場前景廣闊。