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1.1 發(fā)酵飼料的制備與防霉試驗

采用南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院消化道微生物實驗室保存的唾液乳桿菌制備菌液，以8%的添加量將菌液與無抗乳豬配合飼料充分混合均勻，將混合均勻的物料放于密封袋中，排出空氣后封裝，置于37 ℃環(huán)境下發(fā)酵48 h，即得乳酸菌發(fā)酵飼料。

參照相關(guān)試驗報道，本試驗首先在發(fā)酵飼料中分別加入2. 50%丙酸鈣( 分析純，阿拉丁試劑有限公司) 、4. 0%檸檬酸( 分析純，上海西隴化工有限公司) 、0. 30%雙乙酸鈉( 分析純，阿拉丁試劑有限公司) 和0. 25%山梨酸鉀( 分析純，阿拉丁試劑有限公司) ，將上述防霉劑與發(fā)酵飼料混勻后，分別取出200 g 置于普通培養(yǎng)皿中，每組4 個重復(fù)，將培養(yǎng)皿置于溫度28 ℃、相對濕度為72%的恒溫箱中，分別在第1、2、4、6、8、10、15 和30 天取樣分析; 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丙酸鈣和雙乙酸鈉的防霉效果最佳。在此基礎(chǔ)上，將0. 10%、0. 20%、0. 30%和0. 50%的雙乙酸鈉以及1. 50%、2. 00%、2. 50%和3. 00%的丙酸鈣加入到發(fā)酵飼料中，形成不同梯度的添加量，分別取出200 g 置于非密封條件下，每組4 個平行，置于同樣條件下觀察，對照組不添加任何防霉劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加2. 00%的丙酸鈣組和0. 30%的雙乙酸鈉組的防霉效果最佳，基于此結(jié)果，采集飼料樣品用于pH、乳酸、乳酸菌和霉菌指標(biāo)的測定。

1.2 測定指標(biāo)

1.2.1 飼料外觀

分別在試驗開始后第1、2、4、6、8、10、15、30 天觀察飼料的霉變情況，主要包括氣味、結(jié)塊情況、霉變情況以及是否生蟲等，并做記錄。

1.2.2 飼料pH 值

用固體pH 計( HI9124N，哈納沃德儀器( 北京) 有限公司) 分別測定試驗第0、1、2、4、6、8、10 天的三組( 對照組、2. 00%丙酸鈣組和0. 30%的雙乙酸鈉組) 發(fā)酵飼料pH 值。

1.2.3 飼料中乳酸的含量

分別測定試驗開始后，第0、1、2、4、6、8、10 天三組飼料中乳酸含量的變化。取0. 5 g 飼料樣品，加入4. 5 mL 去離子水，震蕩5 min，靜置一段時間后，取上層清液備用待測。采用乳酸試劑盒( A019－ 2，南京建成生物工程研究所) 測定乳酸濃度。

1.2.4 飼料中乳酸菌和霉菌菌落計數(shù)

分別測定試驗第0、1、2、4、6、8、10 天三組飼料中乳酸菌和霉菌含量的變化。將發(fā)酵飼料在無菌條件下取出1 g 到離心管中，加入等量的生理鹽水，混勻后梯度稀釋，取稀釋液100 μL 分別在MRS 以及虎紅平板( 奧博星，北京) 上涂板，每組4 個重復(fù)，乳酸菌在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，霉菌在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤( means ± SEM) 的形式表示，數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel ( 2010) 初步處理后，利用SPSS 18. 0 進(jìn)行單因子方差分析，選擇LSD法進(jìn)行多重比較，顯著性P 值置于0.05。

2.1 飼料的外觀變化

從表1 可見，不添加防霉劑的對照組中的發(fā)酵飼料色澤由正常顏色到變暗，氣味由發(fā)酵飼料特有的酸香味到略有油哈味至霉味、濃霉味。對照組在第4 天即出現(xiàn)點狀霉變和油哈味，而添加雙乙酸鈉、丙酸鈣和山梨酸鉀的三組的發(fā)酵飼料的外觀均無異常，但檸檬酸組出現(xiàn)點狀霉變，而氣味無異常; 第6 天時，對照組出現(xiàn)中度霉變且霉味較明顯，雙乙酸鈉組和丙酸鈣組外觀無異常，檸檬酸組出現(xiàn)點狀霉變且有油哈味，山梨酸鉀組出現(xiàn)點狀霉變但氣味無異常; 第8 天對照組重度霉變且霉味較濃，雙乙酸鈉組和丙酸鈣組出現(xiàn)點狀霉變，但氣味無異常，檸檬酸組組和山梨酸鉀組均出現(xiàn)不同程度的霉變，且霉味較明顯; 試驗結(jié)束時，所有組的飼料均出現(xiàn)重度霉變，霉味濃，對照組、雙乙酸鈉組和丙酸鈣組飼料均有蟲變。

研究表明，在原料中水分含量較高的情況下，雙乙酸鈉可進(jìn)入霉菌細(xì)胞內(nèi)，通過對酶活性的破壞而使霉菌死亡。該結(jié)果與閆革華等報道基本一致，其發(fā)現(xiàn)雙乙酸鈉對生鮮牛奶的防霉效果要優(yōu)于其他防霉劑。丙酸鈣已廣泛用于飼料防霉劑，在本研究中所用的四種防霉劑中，其抑菌譜最廣，對大部分真菌和少部分細(xì)菌都有很好的抑制作用。洪亦武等的研究表明，丙酸鈣對酵母菌、黑曲霉菌、灰綠曲霉菌和煙曲霉均等十幾種霉菌都有較好的抑制作用。山梨酸鉀在水中溶解度較低，因而可能在發(fā)酵飼料中難以發(fā)揮更好的防霉作用; 檸檬酸發(fā)揮防霉抑菌作用主要是依靠降低環(huán)境pH 來實現(xiàn)，由于本試驗所用發(fā)酵飼料的pH 較低，所以檸檬酸難以發(fā)揮其酸性防霉效應(yīng)。試驗結(jié)果表明， 添加量為0. 30% 的雙乙酸鈉和2. 00%的丙酸鈣防霉效果最佳，其原因可能與幾種防霉劑的作用機(jī)制不同有關(guān)。

本試驗中，乳酸濃度在第0 至第1 天時有緩慢增長，這可能是由于發(fā)酵飼料中仍有部分乳酸菌產(chǎn)生少量乳酸。隨著試驗時間繼續(xù)延長，乳酸菌的大量死亡，在第2 天時乳酸含量開始緩慢下降。在保存至第4 天時，雙乙酸鈉組乳酸含量顯著高于丙酸鈣組和對照組，暗示雙乙酸鈉組中的酸性物質(zhì)減少量少于丙酸鈣組和對照組，這可能與雙乙酸鈉的防霉機(jī)理有關(guān)。雙乙酸鈉主要依靠游離出的乙酸分子破壞細(xì)胞內(nèi)的酶系統(tǒng)來抑制微生物的活性，游離的乙酸也可以有效降低飼料的pH，這與雙乙酸鈉組的pH 值一直低于其他兩組吻合。在本試驗中，固態(tài)發(fā)酵飼料的pH 在發(fā)酵結(jié)束后的第2 天開始緩慢升高，并在第10 天達(dá)到7 左右，這意味著發(fā)酵飼料中的乳酸和揮發(fā)性脂肪酸等酸性物質(zhì)已經(jīng)幾乎消耗殆盡，這一結(jié)果與Wang等研究結(jié)果相一致。Missotten 等的研究表明，乳酸菌發(fā)酵液體飼料的pH 會在達(dá)到穩(wěn)定之后緩慢上升，這是由于飼料中菌體的大量死亡裂解，釋放了大量的菌體蛋白，并且飼料中的某些微生物開始利用有機(jī)酸和菌體蛋白產(chǎn)生大量含有堿基的代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)會導(dǎo)致pH 的上升。

黃通旺研究表明，在普通飼料中添加0. 1%的雙乙酸鈉可有效抑制飼料中霉菌的生長，且作用時間可以持續(xù)40 天左右。在本試驗中，雙乙酸鈉和丙酸鈣均可以有效抑制霉菌至第4 天，至第6 天以后飼料中霉菌數(shù)量超出限量標(biāo)準(zhǔn)，而對照組的霉菌數(shù)量在第3 天就已經(jīng)超出限量標(biāo)準(zhǔn)。與黃通旺研究結(jié)果不一致的原因可能是飼料性質(zhì)不同、保存條件不同，發(fā)酵飼料由于水分含量高，并且在本試驗中暴露于空氣中，霉菌更容易大量生長; 而石傳林等在用雙乙酸鈉作為青貯飼料防霉劑時發(fā)現(xiàn)，添加雙乙酸鈉的青貯玉米秸質(zhì)地松軟，顏色黃綠、腐爛少，霉菌計數(shù)結(jié)果顯示比對照組顯著降低，這與本試驗結(jié)果相一致。

考慮到發(fā)酵飼料的主要活性功能物質(zhì)包括乳酸菌等活菌制劑及微生物代謝產(chǎn)物，因此，本實驗同時研究了防霉劑對發(fā)酵飼料中乳酸菌數(shù)量的影響，據(jù)Heres 等報道，在不經(jīng)過特殊處理條件下，乳酸菌液態(tài)發(fā)酵飼料中乳酸菌的數(shù)量在發(fā)酵結(jié)束后5 d 內(nèi)開始大量死亡; Hansen 等也發(fā)現(xiàn)，在液體發(fā)酵飼料中乳酸菌的對數(shù)生長期出現(xiàn)在12 ～ 24 h，在進(jìn)入穩(wěn)定期后24 h 菌體開始裂解并釋放大量菌體蛋白。在本試驗中，添加雙乙酸鈉和丙酸鈣以及對照組的發(fā)酵飼料中乳酸菌數(shù)量總體都呈明顯下降趨勢，與前人的研究結(jié)果一致。而丙酸鈣的抑菌作用相對較強(qiáng)，乳酸菌的繁殖在本試驗的開始即受到抑制，從這一點來看，雙乙酸鈉的防霉效果要優(yōu)于丙酸鈣。試驗同時發(fā)現(xiàn)，隨著保存時間的延長，添加雙乙酸鈉和丙酸鈣的兩組發(fā)酵飼料中乳酸菌的數(shù)量明顯高于對照組，可能是兩種防霉劑抑制了霉菌的大量增殖，飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)依然可以被乳酸菌利用進(jìn)而生長，而對照組中，乳酸菌數(shù)量呈明顯下降趨勢，說明霉菌在大量繁殖的過程中可能競爭性的抑制乳酸菌的生長。