3.4 正交試驗

發酵工藝優化采用3因素3水平L9（33）正交試驗，共設9個處理，每個處理3個重復，各參數水平根據單因素試驗結果，選擇接種量、酶添加量、料水比3個因素進行正交試驗，隨后篩選出優化組合。

3.5 檢測方法

硫苷含量檢測采用氯化鈀分光光度法；硫苷分解產物異硫氰酸酯（ITC）和噁唑烷硫酮（OZT）含量檢測參照國家標準GB 13087-91.GB 13089-91；單寧含量檢測參照國家標準GB/T 15686-2008；植酸含量檢測采用分光光度法；粗蛋白含量檢測采用凱氏定氮法；菜籽肽含量檢測：稱取過80目篩的待測樣品，加入等體積10％三氯乙酸（TCA），在160r/min下振蕩30min，而后4000r/min離心15min，取上清液采用Folin一酚法測定蛋白質總量；菜粕蛋白分布采用SDS—PAGE凝膠電泳；還原糖含量檢測采用DNS分光光度法；鈣含量檢測參照GB／T 13885—2003，磷含量檢測參照GB/T 6437—2002。

4 數據統計分析

數據采用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理和方差分析，多重比較采用LSD法，顯著水平為P<0.05。

結果與分析

1 菌酶協同酵解菜粕方式的確定(見表2)

由表2可知，處理方式3，即菌酶同步發酵，在菜籽肽含量提高和硫苷降解方面，同時取得較好的效果，硫苷降解率達到68.10％，菜籽肽含量為140.78mg／g，比發酵前提高了3.21倍。而處理4，即菌酶分步發酵方式，雖然菜籽肽含量的提高效果明顯，但硫苷降解效果較差。因此，選擇菌酶同步添加的方式進行協同酵解后續的單因素試驗。

2 菌酶協同酵解條件研究

2.1 接種量對菜籽肽含量的影響(見圖1)

隨著接種量的增加，菜籽肽含量呈現先增加、后下降的變化過程。當接種量為1.5％時，菜籽肽含量達156.4mg／g，接種量為2％時，菜籽肽含量達164.3mg／g，增加幅度不大，因此本試驗選擇適宜接種量為1.5％。

2.2 酶添加量對菜籽肽含量的影響(見圖2）

圖2表明，當中性蛋白酶添加量為100U／g時，菜籽肽含量達到161.2mg／g；當酶添加量為250U／g時，菜籽肽含量最高，達166.4mg／g，與添加100U／g相比，增加幅度不大，考慮到加酶成本，本試驗確定酶的適宜添加量為100U／g。

2. 3 料水比對菜籽肽含量的影響(見圖3）

結果表明，隨著發酵體系中水分含量的增加，菜籽肽含量呈逐漸增加的趨勢，但考慮到含水率增加時，會顯著影響到硫苷的脫毒效果，而料水比在1：1、1：1.1和1：1.2時，對菜籽肽含量的影響不大，因此確定最適料水比為1：1。

2.4 菌酶協同酵解條件的正交試驗

以菜籽肽含量為指標，選取接種量、酶添加量和料水比進行3因素3水平正交試驗試驗，因素水平編碼表和設計實施方案見表3。試驗結果及方差分析見表4和表5。

正交試驗的結果顯示，接種量、酶添加量和料水比3個因素中，酶添加量和接種量是影響小肽含量的顯著因素。3個因素對小肽含量的影響，依次為酶添加量>接種量>料水比。根據正交試驗結果確定的最佳發酵條件為：接種量為1.0％，酶添加量為150U／g，料水比為1：1.0。

3 菌酶協同酵解菜粕營養成分分析

根據正交試驗得到的最佳條件，進行菌酶協同酵解菜籽粕，并對處理前后的菜籽粕進行了營養成分分析和蛋白凝膠電泳，結果見表6和圖4。

討論

菜籽粕中存在較多的抗營養因子，其中硫苷是最主要的抗營養因子，其含量較高。物理法和化學法脫毒存在耗能高、蛋白損失大、成本昂貴等缺陷限制了其使用，微生物發酵法脫毒因其在很多方面能克服物理和化學法的缺點而受到普遍的重視和應用。本試驗中，采用微生物發酵協同酶解處理后，菜籽粕中硫苷的降解率達74.23％，與黃茜等利用篩選獲得的枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌和釀酒酵母進行菜粕發酵，得到硫苷的降解率達到89.06％的結果一致。同時，試驗還表明，通過發酵可提高菜籽粕中的粗蛋白含量。劉軍等從土壤中分離出若干霉菌、酵母菌和細菌，對其中3支菌株混合發酵，結果菜粕的粗蛋白含量提高了23％；國外Adarsh Palvigl利用少孢根霉發酵菜籽餅粕也發現蛋白含量得到增加。試驗證實了微生物發酵是改良菜籽粕的有效手段。

目前，對植物源蛋白及活性肽的研究日益成為食品、醫藥及飼料等領域的熱點。本試驗中小肽含量比發酵前提高了3.7倍，菜籽粕中還原糖、Ca、P含量分別比發酵前提高了57.68％、26.83％和11.57％。同時SDS—PAGE蛋白凝膠電泳結果也表明，菜粕經菌酶協同酵解后，蛋白組分中高于25kD的大分子蛋白得到了較充分的降解。據報道，用蛋白酶酶解制備菜籽肽，可得到分子量較小的小肽，且蛋白水解度較高。但作為飼料添加劑生產成本太高，同時酶解法對植物源蛋白中抗營養因子的去除效果并不理想。采用菌酶協同酵解法制備菜籽肽，枯草芽孢桿菌能分解其中的抗營養因子作為營養物質供自身的生長，從而達到脫毒的效果，同時外源蛋白酶與微生物發酵產生的酶，將大分子量的蛋白降解為小分子量的蛋白肽，可有效提高菜粕的品質及蛋白利用率，為菜籽粕的深入開發提供新的途徑。

結論

本試驗對菌酶協同酵解生產高品質菜粕的發酵工藝進行了研究，通過單因素及正交試驗，確定了采用枯草芽孢桿菌與中性蛋白酶同步發酵的方式，當接種量為1.0％，酶添加量為150U／g，料水比為1：1.0，發酵溫度為35℃，發酵時問為48h時，菜籽粕中硫代葡萄糖苷(硫苷)的降解率達74.23％，其分解產物異硫氰酸酯(ITC)和嗯唑烷硫酮(OZT)的含量分別比發酵前降低了79.07％和55.56％；發酵后菜粕中單寧和植酸含量分別降低了31.17％和16.39％；發酵后菜籽粕中粗蛋白含量達41.30％，比發酵前提高1.92％，菜籽肽含量達170.12mg/g，比發酵前提高了3.7倍，還原糖含量比發酵前提高了57.68％，鈣、磷含量分別比發酵前提高了26.83％和11.57％。同時，SDS—PAGE電泳結果表明，菌酶協同酵解工藝處理后，菜籽蛋白中大分子量亞基均得到較好的降解效果。

實戰操作技術——棉菜籽餅脫毒變身優質飼料替代豆粕操作新技術

當前豆粕價格很高有些地方貨源緊缺，而棉菜籽餅（棉籽粕、菜籽粕）價格相對便宜，棉菜籽餅是棉子、油菜籽榨油后剩下的餅狀殘渣，蛋白質含量較高，含有各種氨基酸成分。但由于棉菜籽餅中含有植酸、芥子堿等物質，這些物質含有一定的毒性，還會影響動物的消化吸收，不能大量使用，因此不建議直接飼喂給動物！

現在通過微生物飼料發酵劑的除毒脫毒技術，可以成功將菜籽餅變為優質添加飼料，直接按照1公斤發酵的棉菜籽餅（發酵前的重量）代替約0.85公斤豆粕進行使用。飼料發酵劑中的有益微生物，在發酵過程中分泌的代謝產物，可將棉菜籽餅中的毒性物質等有效分解。

豆粕、菜粕、棉粕成分對比

1.豆粕是一種高蛋白原料，無需脫毒即可用作飼料。其中蛋白質含量為40%-48%，賴氨酸含量為2.5%-3.0%，色氨酸含量為0.6%-0.7%，蛋氨酸含量為0.5%-0.7%。2020年11月12日報價每噸在3500元左右。

2.菜粕的粗蛋白含量在34%-38%之間，特點是蛋氨酸含量高（僅次于芝麻餅、粕），賴氨酸含量亦高。而精氨酸含量低，是餅、粕飼料中含量最低的。菜籽粕的有效能值偏低（淀粉含量低、菜籽殼難以消化利用）。礦物質中，鈣和磷的含量均高，硒和錳的含量亦高。特別是硒的含量是常用植物飼料中最高的。2020年11月12日報價每噸在2900元左右。

3.棉粕蛋白質含量一般為44.32%，僅次于豆粕的蛋白質含量48%，而高于菜籽粕的蛋白質含量36.04%。精氨酸含量高達3.6%-3.8%，而賴氨酸含量僅有1.3%-l.5%，只有豆粕的一半。2020年11月12日報價每噸在3000元左右。

是否需要脫毒處理

1.豆粕無需經過脫毒即可用作飼料。而且豆粕中富含蛋白質和多種氨基酸，在不需要額外加入動物性蛋白的情況下，僅豆粕中含有的蛋白質和氨基酸足以平衡家禽和豬的食譜，促進它們的營養吸收。只有當其他粕類單位蛋白成本遠低于豆粕時，豆粕才有可能被替代。

2.菜粕菜籽中含有硫葡萄糖苷、芥酸、單寧、皂角苷等不良成分，其中主要是硫葡萄糖苷。硫葡萄糖苷本身無毒，但在一定溫度和水分條件下，經過菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而產生異硫氰酸酯、唑烷硫酮和腈類等有害物質。這些物質可引起甲狀腺腫大，從而造成動物生長速度下降，繁殖力減退。單寧則妨礙蛋白質的消化，降低適口性。而芥酸阻撓脂肪代謝，造成心臟脂肪蓄積及生長受到抑制。。使用前需進行一定的脫毒處理，并且使用時要加以限制，具體喂量應根據菜粕中有害成分含量而定。經過脫毒處理的菜籽粕喂量可以加大，而“雙低”油菜籽生產的菜粕喂量要受限制。同時，應結合菜粕的氨基酸組成特點，適當搭配其它餅粕。

3.棉籽中含有對動物有害的棉酚及環丙烯脂肪酸，尤其是棉酚的危害很大。在制油過程中，由于蒸炒，壓榨等熱作用，大部分棉酚與蛋白質、氨基酸結合而變成結合棉酚，結合棉酚在動物消化道內不被動物吸收，故毒性很小。另一部分棉酚則以游離形式存在于餅、粕及油品中，這部分游離棉酚對動物毒性較大，尤其單胃動物過量攝取或攝取時間較長，可導致生長遲緩、繁殖性能及生產性能下降，甚至導致死亡。幼小動物對棉酚的耐受能力更低。由于棉籽餅、粕中游離棉酚對動物有害，因此，在使用棉餅、粕時，要根據飼喂對象及餅粕中游離棉酚的含量加以限量。反芻家畜在有優質粗料及多汁青料的情況下，棉籽餅、粕的用量不受限制，不會造成中毒。對單胃動物要限制喂量，最好使用經過脫毒處理的棉籽餅粕。同時，使用棉籽餅、粕配制飼糧要注意氨基酸平衡，尤其是棉籽餅、粕的賴氨酸含量低，且利用率差，應注意添加賴氨酸。

發酵操作技術

發酵棉菜籽餅其實也是一個脫毒技術，具體操作如下：

1.仔細檢查棉菜籽餅，剔除棉菜籽餅中嚴重變質發霉的部分，輕度發霉的原料可以忽略，因為微生物發酵能夠脫霉。

2.將棉菜籽餅粉碎并添加適量的玉米粉淀粉類的能量飼料等，調節飼料營養比例。

3.每噸棉菜籽餅加入2公斤食鹽、玉米粉（其它淀粉、面粉次粉等也可以，或者粉碎的生紅薯300公斤也可以）100公斤、“99多功能飼料發酵劑”1包（500g/包，市場售價約25元，以高濃度乳酸菌、酵母菌、復合酶制劑的專業發酵劑）。

4.在混合物料中添加適量水分，使混合物料含水量保持在55%左右，以“手抓一把并緊握，無水滴落，松手后輕觸即散”為宜，一般上述配方中需要加入清水約500-600公斤。

5.發酵方式根據實際環境條件各異，在桶、缸、塑料袋等容器中發酵均可。

6.發酵時要盡可能排盡空氣進行密封發酵。如果使用的發酵容器有密封不嚴實的隱患，要在一開始就在其外層包裹一層塑料袋并扎緊。發酵過程中不能啟封。

7.發酵時間受環境溫度影響，通常夏季發酵2-3天，冬季發酵5-7天即可完成。發酵完成后，有較為強烈的酸香味，ph值在3-4。

規模運用混合發酵現場

塑料缸、飼料袋（有內膜）均可做發酵飼料

采用池子發酵

發酵完成的棉菜粕飼喂動物技術

需要注意的是，發酵后的飼料酸度較低，不可以取代禽畜全部日糧。其他類發酵飼料同理。飼喂時根據不同情況，將發酵飼料按照一定比例添加到日糧中，發酵完成的棉菜粕為濕料，具體使用量每大概1.5-2公斤發酵棉菜粕（濕料）代替動物日糧配方中1公斤豆粕的使用量進行代替使用，與其它飼料混合后直接飼喂，由于棉菜籽粕蛋白較高，最高使用量不要超過禽畜日糧飼喂量的40%（濕料重量）。如果發現發酵飼料過酸適口性變差，可在飼喂前在陽光下曬1-2小時，或添加適量的碳酸氫鈉（小蘇打）即可改善。

發酵過程中與發酵后使用過程中，發酵的容器要一直保持密封狀態，可以長時間保存（一年左右）。

當前養殖業成本高居不下，而飼料成本是其中最高的，利用廉價原料發酵飼料（包括一些輕度發霉的粕類低價收回）是極佳解決辦法。通過微生物飼料發酵劑的發酵作用，可以將輕度霉變飼料變成優質飼料，將不易消化的物質分解為可被畜禽吸收的小分子糖類、氨基酸等。同時發酵飼料中富含有益微生物、酶制劑、酸化劑等，可調節畜禽腸胃微生態環境并進一步提高飼料利用率。發酵飼料氣味清香，提高了飼料的適口性，加上發酵飼料中有大約4℃的酒度，能夠促進動物新陳代謝促進健康抵御疾病，是當前養殖業發展中重要的一環。

本技術也可以同樣發酵菜籽粕（餅）、棕櫚粕等，方法同上。

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