1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品

實驗室保藏芽孢桿菌菌株，篩選自養殖場土壤、畜禽糞便等樣品。

1.1.2 試驗菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、痢疾桿菌（Shigella Castellani）由河北農業大學制藥工程實驗室提供。

1.1.3 培養基

NA培養基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂1.5%~2.0%，pH值7.2~7.4。NB培養基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L，pH值7.2~7.4。發酵培養基：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化鈉8.5g/L、磷酸二氫鉀1g/L、葡萄糖1g/L。LB培養基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L，pH值7.2。

1.2 菌株初篩

活化大腸桿菌菌種，并制備發酵液。將大腸桿菌培養液按1%的比例加到NA培養基中，充分混勻倒板，制成大腸桿菌病原菌平板。將實驗室4℃冰箱保藏的單菌落菌株，采用十字劃線法接種到大腸桿菌平板上，37℃培養觀察其對大腸桿菌的拮抗情況。

1.3 菌株復篩

在初篩獲得的菌株中，為了排除是生長競爭所導致大腸桿菌沒有生長，采取平板擴散法進行復篩，觀察抑菌圈直徑。參照1.2和1.3的方法，將復篩得到的菌株依次用于沙門氏菌和痢疾桿菌拮抗菌的篩選，綜合對3株病原菌的抑菌能力優選出3株拮抗菌進行后續研究。

1.4 功能菌株的種屬鑒定

參照《常見細菌系統鑒定手冊》對菌株進行形態學觀察。通過16SrDNA序列分析進行分子學鑒定，通過測序結果進行同源性比較，建立系統發育樹，初步確定種屬地位。

1.5 功能菌株的性質研究

1.5.1 功能菌株在不同pH值下的生長情況

制備功能菌株種子液，以1%的接種量轉接于pH值為3.5、4.5、5.5、6.5的100mL發酵培養基中。37℃、180r/min培養48h，測定發酵液在600nm下的吸光值。

1.5.2 功能菌株在不同溫度下的生長情況

制備功能菌株種子液，以1%的接種量轉接于100mL發酵培養基中，分別在27、37、47℃，180r/min培養48h，測定發酵液在600nm下的吸光值。

1.5.3 功能菌株在不同膽鹽濃度下的生長情況

制備功能菌株種子液，以1%的接種量轉接于膽鹽濃度分別為0、0.15、0.30、0.60g/L的100mL發酵培養基中，37℃、180r/min培養48h，測定發酵液在600nm下的吸光值。

1.6 功能菌株產消化酶情況

1.6.1 菌株產蛋白酶情況

通過平板擴散法將菌株發酵液離心上清液加入添加了10%脫脂奶粉的LB平板中，37℃培養觀察是否有水解圈。

1.6.2 菌株產淀粉酶情況

通過平板擴散法將菌株發酵液離心上清液加入添加了1%淀粉的LB平板中，37℃培養48h，加入碘液觀察是否有水解圈。

1.6.3 菌株產纖維素酶情況

通過平板擴散法將菌株發酵液離心上清液加入剛果紅平板中，37℃培養48h觀察是否有水解圈。

1.6.4 菌株產脂肪酶情況

通過平板擴散法將菌株發酵液離心上清液加入添加了1%三丁酸甘油酯的平板中。37℃培養72h觀察是否出現水解圈。

2結果與分析

AGP作為一種非營養型的飼料添加劑，在促進動物生長，提高動物生產性能方面起著積極的作用，但是長期使用抗生素，會使病菌的抗藥性增強，從而造成不同程度的感染。近年來，細菌耐藥性等問題日益突出，無毒、無公害的微生態飼料添加劑的研究和開發顯得日益重要。隨著人們對更安全、優質的畜禽產品的追求，無抗養殖成為大勢所趨，發酵飼料將起著非常重要的作用。目前，用于發酵飼料的添加劑有酸化劑、益生菌、酶制劑等物質，其中益生菌具有促進動物腸道有益菌群的形成等優勢，受到廣泛好評。近幾年，研究發現益生菌也可以直接添加到飼料中，操作簡便、成本較低廉、不會破壞飼料中的營養成分，還能提高飼料報酬，確保畜牧業安全生產，同時提高了經濟效益。芽孢桿菌所進行的生物轉化法能夠產生抑制大腸桿菌生長的益生作用，抑制有害病原菌的生長和增強抵抗疾病的能力，可以廣泛應用于畜牧行業中。

本研究得到的3株益生芽孢桿菌可以拮抗3種腸道病原菌的生長，并且可以耐受胃酸和膽鹽的環境，這樣就可以保證菌株隨著發酵飼料進入腸道后有定植的可能，進一步發揮抗病的功能。近年來，一些真菌、細菌的代謝產物被證實能夠起到益生作用，但大部分不可以直接加入飼料中對牲畜直接投喂，其提取產物的過程較為復雜、成本高。動物飼料中添加各種酶有利于動物生產，因為酶可以幫助消化飼料，提升飼料報酬，故酶制劑在動物生產中應用廣泛。利用飼用益生菌本身產酶特性制備微生態制劑，在動物消化也可起到重要作用。本研究得到的3株芽孢桿菌均可以產生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶，具備益生菌的潛質。芽孢桿菌可以形成芽孢體，抗逆性強，有利于產品的生產工藝和貯藏，進而保證產品的質量。本研究得到的菌株可以在不同的溫度生長，并且可以耐受較低的pH值環境，這樣就能解決菌株的干燥不耐高溫和倉儲期短的問題。因此，本研究篩選到的芽孢桿菌可以很好地應用于發酵飼料中，能達到減抗、替抗的效果，尤其是菌株B-1d為枯草芽孢桿菌，在飼料添加劑的目錄中，可直接用于畜禽行業。