菜籽粕是油菜籽經預壓浸出工藝處理后得到的副產物，含蛋白質、粗纖維較豐富，目前菜籽粕經脫毒處理后是制作牲畜與家禽飼料的主要原料，還可以用于制作食品、化妝品和抗菌素原料。飼用復合酶是一種飼料添加劑，它的主要成分包括蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等。飼用復合酶能有效分解飼料中的抗營養因子，釋放營養物質，使其能被充分消化吸收，提高飼料的利用率，改善動物的生產性能等。目前國內外對菜籽粕研究報道較多，主要集中在脫毒、滅菌條件、以及作為飼料組分等方面，對菜籽粕的綜合利用報道較少。本課題利用混菌固態發酵菜籽粕生產飼用復合酶，并對其培養基優化。通過單因素實驗對培養基成分及配比進行研究，確定最佳培養基配方。在此條件下進行發酵，進一步提高復合酶產量，對降低其生產成本，提高其市場競爭力有重要意義。

1.材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌，毛霉，酵母菌，購于中國微生物菌種保藏中心，由本院生物制藥國家重點實訓基地保藏。

斜面培養基：PDA培養基：馬鈴薯（去皮）20%，葡萄糖：2%，瓊脂：2%；牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏：0.3%，蛋白胨：1%，Na-Cl：0.5%，瓊脂：2%。

CBV-1500A超凈工作臺（上海瑞仰凈化裝備有限公司）；

HH.SYH-Ni2-C水浴鍋（北京長源實驗設備廠）；

QYC.2102恒溫培養搖床（上海福瑪實驗設備有限公司）；

HPS-250生化培養箱（哈爾濱東明醫療儀器廠）；

UV-9100紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 菜籽粕的預處理

利用乙醇法脫毒，脫除有毒物質硫甙等物質，達到脫毒目的。

1.2.2 混菌發酵實驗

裝50g菜籽粕發酵培養基于250mL搖瓶中，按1∶1∶1比例接入枯草芽孢桿菌、毛霉、酵母菌混合菌種，于溫度為36℃、轉速為200轉/分的搖床上發酵培養3d，測定蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶活力，以三酶活力之和作為評價指標，評價復合酶性能。

1.2.3 蛋白酶活力測定

按GB/T23527-2009進行。酶活力單位定義：在pH7.0、40℃條件下，每分鐘水解酪蛋白產生1μg酪氨酸所需的酶量為1個蛋白酶活力單位（U）。

1.2.4 淀粉酶活力測定

采用DNS法進行測定。淀粉酶活力單位定義:在pH5.5、50℃條件下，1min分解淀粉釋放出1μg還原糖所需的酶量為1個蛋白酶活力單位（U）。

1.2.5 纖維素酶活力測定

采用DNS法進行測定。纖維素酶活力單位定義：在50℃條件下，在1min內酶解生成1μg還原糖的酶量為1U。

1.2.6 飼用復合酶總活力

計算公式如下：

飼用復合酶總活力=蛋白酶活力+淀粉酶活力+纖維素酶活力

1.2.7 菜籽粕培養基配方優化

以脫毒后的菜籽粕為主要原料，選擇不同的無機鹽（氯化鈣、氯化銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸錳）和表面活性劑（吐溫-80）為單因素進行實驗，探究各因素對飼用復合酶的影響。

取5個250mL搖瓶，裝入50g脫毒后的菜籽粕，并分別添加0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%的氯化鈣，按5%比例接入混合菌種，置于溫度36℃、轉速200r/min的搖床發酵培養3d。

取5個250mL搖瓶，裝入50g脫毒后的菜籽粕，并分別添加0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的氯化銨，按5%比例接入混合菌種，置于溫度36℃、轉速200r/min的搖床發酵培養3d。

取5個250mL搖瓶，裝入50g脫毒后的菜籽粕，并分別添加1%、1.5%、2%、2.5%、3%的磷酸氫二鉀，按5%比例接入混合菌種，置于溫度36℃、轉速200r/min的搖床發酵培養3d。

取5個250mL搖瓶，裝入50g脫毒后的菜籽粕，并分別添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的硫酸鎂，按5%比例接入混合菌種，置于溫度36℃、轉速200r/min的搖床培養3d。

取5個250mL搖瓶，裝入50g脫毒后的菜籽粕，并分別添加0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的硫酸錳，按5%比例接入混合菌種，置于溫度36℃、轉速200r/min的搖床培養3d。

取5個250mL搖瓶，裝入50g脫毒后的菜籽粕，并分別添加0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的吐溫-80，按5%比例接入混合菌種，置于溫度36℃、轉速200r/min的搖床發酵培養3d。

2.結果與分析

2.1 氯化鈣對飼用復合酶活力的影響

按實驗方法實驗所得氯化鈣對飼用復合酶活力的影響如表1。從表1可知，氯化鈣對飼用復合酶活力有明顯的激活作用，在0.05%～0.25%的考察范圍內，飼用復合酶活力與氯化鈣添加量呈正相關，當氯化鈣添加量為0.1%時，飼用復合酶總活力達到5496U/g，繼續增加氯化鈣添加量，總酶活增加不明顯。綜合考慮，氯化鈣最佳添加量為0.1%。

2.2 氯化銨對飼用復合酶活力的影響

氯化銨對飼用復合酶活力影響見表2。從表2可知，氯化銨對飼用復合酶活力影響呈“鐘罩形”，當氯化銨添加量為1.5%時，飼用復合酶總活力達到最大值4673 U/g，再增加氯化銨的量，酶活反而下降。其原因是氯化銨在培養基中主要是充當氮源，當其含量過量時，會影響培養基的C/N比，反而不利于發酵。因此，最佳氯化銨添加量應為1.5%。

2.3 磷酸氫二鉀對飼用復合酶活力的影響

磷酸氫二鉀對飼用復合酶活力的影響如圖1所示。

圖1磷酸氫二鉀對飼用復合酶活力的影響從圖1可知，磷酸氫二鉀對飼用復合酶活力有明顯的促進作用，在1%～3%考察范圍內，當磷酸氫二鉀添加量為2%，飼用復合酶總酶活為5124U/g。因此，磷酸氫二鉀最佳添加量為2%。

2.4 硫酸鎂對飼用復合酶活力的影響

硫酸鎂對飼用復合酶活力的影響如圖2所示。從圖2可知，當硫酸鎂添加量為0.2%時，飼用復合酶總活為5269U/g。其原因是Mg2+對蛋白酶、淀粉酶均有一定激活作用。因此，硫酸鎂最佳添加量為0.2%。

2.5 硫酸錳對飼用復合酶活力的影響

硫酸錳對飼用復合酶活力的影響如圖3所示，圖中顯示當硫酸錳添加量為0.5%時，飼用復合酶總酶活達到5869U/g。因此，硫酸錳最佳添加量為0.5%。

2.6 吐溫-80對飼用復合酶活力的影響

吐溫-80對飼用復合酶活力的影響如圖4所示，從圖可以，吐溫-80在一定范圍內能提高酶活力，但其添加量超過1%時，酶活反而下降。吐溫-80是一種表面活性劑，它可以提高細胞的通透性，從而促進酶的釋放，但當其添加量過高時，會影響細胞生長而不利于產物的積累。因此，吐溫-80最佳添加量為1%。

3.結論

本實驗采用單因素法研究了混菌發酵菜籽粕產飼用復合酶的培養基條件。確定了最佳發酵條件為，以脫毒菜籽粕為原料，添加0.1% CaCl2、1.5% NH4Cl、2% K2HPO4、0.2% MgSO4、0.5%MnSO4以及1% Tween-80。在該條件下飼用復合總酶活達到5994U/g，提高了飼用復合酶產量，對飼用復合酶生產有一定指導意義。

實戰操作技術——棉菜籽餅脫毒變身優質飼料替代豆粕操作新技術

當前豆粕價格很高有些地方貨源緊缺，而棉菜籽餅（棉籽粕、菜籽粕）價格相對便宜，棉菜籽餅是棉子、油菜籽榨油后剩下的餅狀殘渣，蛋白質含量較高，含有各種氨基酸成分。但由于棉菜籽餅中含有植酸、芥子堿等物質，這些物質含有一定的毒性，還會影響動物的消化吸收，不能大量使用，因此不建議直接飼喂給動物！

現在通過微生物飼料發酵劑的除毒脫毒技術，可以成功將菜籽餅變為優質添加飼料，直接按照1公斤發酵的棉菜籽餅（發酵前的重量）代替約0.85公斤豆粕進行使用。飼料發酵劑中的有益微生物，在發酵過程中分泌的代謝產物，可將棉菜籽餅中的毒性物質等有效分解。

豆粕、菜粕、棉粕成分對比

1.豆粕是一種高蛋白原料，無需脫毒即可用作飼料。其中蛋白質含量為40%-48%，賴氨酸含量為2.5%-3.0%，色氨酸含量為0.6%-0.7%，蛋氨酸含量為0.5%-0.7%。2020年11月12日報價每噸在3500元左右。

2.菜粕的粗蛋白含量在34%-38%之間，特點是蛋氨酸含量高（僅次于芝麻餅、粕），賴氨酸含量亦高。而精氨酸含量低，是餅、粕飼料中含量最低的。菜籽粕的有效能值偏低（淀粉含量低、菜籽殼難以消化利用）。礦物質中，鈣和磷的含量均高，硒和錳的含量亦高。特別是硒的含量是常用植物飼料中最高的。2020年11月12日報價每噸在2900元左右。

3.棉粕蛋白質含量一般為44.32%，僅次于豆粕的蛋白質含量48%，而高于菜籽粕的蛋白質含量36.04%。精氨酸含量高達3.6%-3.8%，而賴氨酸含量僅有1.3%-l.5%，只有豆粕的一半。2020年11月12日報價每噸在3000元左右。

是否需要脫毒處理

1.豆粕無需經過脫毒即可用作飼料。而且豆粕中富含蛋白質和多種氨基酸，在不需要額外加入動物性蛋白的情況下，僅豆粕中含有的蛋白質和氨基酸足以平衡家禽和豬的食譜，促進它們的營養吸收。只有當其他粕類單位蛋白成本遠低于豆粕時，豆粕才有可能被替代。

2.菜粕菜籽中含有硫葡萄糖苷、芥酸、單寧、皂角苷等不良成分，其中主要是硫葡萄糖苷。硫葡萄糖苷本身無毒，但在一定溫度和水分條件下，經過菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而產生異硫氰酸酯、唑烷硫酮和腈類等有害物質。這些物質可引起甲狀腺腫大，從而造成動物生長速度下降，繁殖力減退。單寧則妨礙蛋白質的消化，降低適口性。而芥酸阻撓脂肪代謝，造成心臟脂肪蓄積及生長受到抑制。。使用前需進行一定的脫毒處理，并且使用時要加以限制，具體喂量應根據菜粕中有害成分含量而定。經過脫毒處理的菜籽粕喂量可以加大，而“雙低”油菜籽生產的菜粕喂量要受限制。同時，應結合菜粕的氨基酸組成特點，適當搭配其它餅粕。

3.棉籽中含有對動物有害的棉酚及環丙烯脂肪酸，尤其是棉酚的危害很大。在制油過程中，由于蒸炒，壓榨等熱作用，大部分棉酚與蛋白質、氨基酸結合而變成結合棉酚，結合棉酚在動物消化道內不被動物吸收，故毒性很小。另一部分棉酚則以游離形式存在于餅、粕及油品中，這部分游離棉酚對動物毒性較大，尤其單胃動物過量攝取或攝取時間較長，可導致生長遲緩、繁殖性能及生產性能下降，甚至導致死亡。幼小動物對棉酚的耐受能力更低。由于棉籽餅、粕中游離棉酚對動物有害，因此，在使用棉餅、粕時，要根據飼喂對象及餅粕中游離棉酚的含量加以限量。反芻家畜在有優質粗料及多汁青料的情況下，棉籽餅、粕的用量不受限制，不會造成中毒。對單胃動物要限制喂量，最好使用經過脫毒處理的棉籽餅粕。同時，使用棉籽餅、粕配制飼糧要注意氨基酸平衡，尤其是棉籽餅、粕的賴氨酸含量低，且利用率差，應注意添加賴氨酸。

發酵操作技術

發酵棉菜籽餅其實也是一個脫毒技術，具體操作如下：

1.仔細檢查棉菜籽餅，剔除棉菜籽餅中嚴重變質發霉的部分，輕度發霉的原料可以忽略，因為微生物發酵能夠脫霉。

2.將棉菜籽餅粉碎并添加適量的玉米粉淀粉類的能量飼料等，調節飼料營養比例。

3.每噸棉菜籽餅加入2公斤食鹽、玉米粉（其它淀粉、面粉次粉等也可以，或者粉碎的生紅薯300公斤也可以）100公斤、“99多功能飼料發酵劑”1包（500g/包，市場售價約25元，以高濃度乳酸菌、酵母菌、復合酶制劑的專業發酵劑）。

4.在混合物料中添加適量水分，使混合物料含水量保持在55%左右，以“手抓一把并緊握，無水滴落，松手后輕觸即散”為宜，一般上述配方中需要加入清水約500-600公斤。

5.發酵方式根據實際環境條件各異，在桶、缸、塑料袋等容器中發酵均可。

6.發酵時要盡可能排盡空氣進行密封發酵。如果使用的發酵容器有密封不嚴實的隱患，要在一開始就在其外層包裹一層塑料袋并扎緊。發酵過程中不能啟封。

7.發酵時間受環境溫度影響，通常夏季發酵2-3天，冬季發酵5-7天即可完成。發酵完成后，有較為強烈的酸香味，ph值在3-4。

規模運用混合發酵現場

塑料缸、飼料袋（有內膜）均可做發酵飼料

采用池子發酵

發酵完成的棉菜粕飼喂動物技術

需要注意的是，發酵后的飼料酸度較低，不可以取代禽畜全部日糧。其他類發酵飼料同理。飼喂時根據不同情況，將發酵飼料按照一定比例添加到日糧中，發酵完成的棉菜粕為濕料，具體使用量每大概1.5-2公斤發酵棉菜粕（濕料）代替動物日糧配方中1公斤豆粕的使用量進行代替使用，與其它飼料混合后直接飼喂，由于棉菜籽粕蛋白較高，最高使用量不要超過禽畜日糧飼喂量的40%（濕料重量）。如果發現發酵飼料過酸適口性變差，可在飼喂前在陽光下曬1-2小時，或添加適量的碳酸氫鈉（小蘇打）即可改善。

發酵過程中與發酵后使用過程中，發酵的容器要一直保持密封狀態，可以長時間保存（一年左右）。

當前養殖業成本高居不下，而飼料成本是其中最高的，利用廉價原料發酵飼料（包括一些輕度發霉的粕類低價收回）是極佳解決辦法。通過微生物飼料發酵劑的發酵作用，可以將輕度霉變飼料變成優質飼料，將不易消化的物質分解為可被畜禽吸收的小分子糖類、氨基酸等。同時發酵飼料中富含有益微生物、酶制劑、酸化劑等，可調節畜禽腸胃微生態環境并進一步提高飼料利用率。發酵飼料氣味清香，提高了飼料的適口性，加上發酵飼料中有大約4℃的酒度，能夠促進動物新陳代謝促進健康抵御疾病，是當前養殖業發展中重要的一環。

本技術也可以同樣發酵菜籽粕（餅）、棕櫚粕等，方法同上。

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