復合益生菌發酵豆粕生產工藝參數的優化及酶菌聯合發酵對豆粕品質的影響
豆粕以其良好的營養特性被譽為植物性蛋白質飼料“之王”，成為蛋白質資源的首選。然而由于豆粕中含有多種抗營養因子，如胰蛋白酶抑制劑、植物凝集素、低聚糖和抗原蛋白等限制其使用。近幾年來，國內大豆生產量下滑，加之畜牧業的發展使對豆粕的需求旺盛，其需求大和資源緊缺的矛盾日益突出，給飼料工業帶來了嚴峻的挑戰。當前，提高豆粕的營養價值和利用效率一直是理論研究和實際生產需求的熱點課題。而利用益生菌進行發酵處理是一條經濟有效的途徑。
益生菌發酵可將豆粕中大分子蛋白質降解為多肽、小肽及游離氨基酸，除去多種抗營養因子，平衡豆粕氨基酸，提高其消化利用率。經發酵處理的豆粕還富含益生菌體、有機酸和多功能小肽等活性物質，能緩解仔豬斷奶應激、降低仔豬腹瀉率、改善畜禽胴體品質、提高動物生產性能和免疫能力。
當前，關于不同發酵方式改善豆粕品質的研究已屢見不鮮，但絕大部分試驗參數是基于實驗室小試條件下高料水比發酵的結果，與實際大規模生產需求存在一定差距。另外，傳統豆粕的處理一般采用微生物發酵或者添加外源蛋白酶酶解2種途徑，而將微生物與蛋白酶聯合處理豆粕的研究鮮有報道。為此，本試驗模擬實際生產中發酵料層高度，原料粉碎粒度采用工廠生產標準并且不經滅菌處理，發酵用水量設計在更具經濟價值的低水分區段，通過篩選出最優復合益生菌發酵豆粕工藝參數并進一步研究蛋白酶對其發酵品質的影響，以期為實際生產中豆粕資源的高效、低成本利用提供理論依據。
1材料與方法
1.1 試驗材料
豆粕，粗蛋白質含量為43.36%(實測)，粉碎過3.0篩板;釀酒酵母(Saccharomy cescerevisae)，酵母活菌數≥2.0×1010個/g，購自安琪酵母股份有限公司;米曲霉(Aspergillus oryzae)，有效孢子含量≥2.0×109個/g，購自百惠生物科技有限公司;枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，有效孢子含量≥2.0×1010個/g，購自安琪酵母股份有限公司;發酵用蛋白酶，有效成分為中性蛋白酶，活性為30000IU/g，購自湖南利爾康生物有限公司。
1.2 試驗設計
第1步:主要采用對比試驗，涉及發酵豆粕4個料水比水平(1∶0.3、1∶0.4、1∶0.5、1∶0.6，風干基礎)在不同發酵時間段(0、24、48、72h)的變化，每個組3個重復，各個時間點連續采樣，在此基礎上通過測定不同時間點的發酵效果來選擇最優發酵參數。第2步:在該推薦發酵參數的基礎上設計加酶試驗組和無酶對照組，通過測定粗蛋白質、真蛋白質、干物質、粗灰分、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和游離氨基酸含量，以研究添加蛋白酶對豆粕發酵品質的影響。
1.3 豆粕發酵方法
將96%豆粕、2%麥麩和2%玉米粉混合均勻。根據本課題組前期所做的不同微生物發酵豆粕的添加量及配比參數，按原料重的0.5%計算菌粉總添加量，再根據釀酒酵母∶米曲霉∶枯草芽孢桿菌=5∶1∶2的比例計算各菌粉接種量。發酵用水按不同料水比計算添加。底物混合均勻后裝入發酵桶(每桶裝量約30kg)于室溫(28～29℃)下發酵。
1.4 豆粕發酵參數的優化
按上述方法混合不同料水比發酵底物(不添加蛋白酶)，每個料水比做3個重復，發酵至72h，期間在0、24、48、72h開蓋，測定物料中心溫度，并每次移取約200g樣品，取3.00g鮮樣測定pH，剩余鮮樣65℃烘干，粉碎過40目篩，陰涼干燥處保存待測其他指標。
1.5 添加蛋白酶對發酵豆粕品質的影響
在推薦發酵參數下，按照上述方法混合發酵底物，對照組不加酶，試驗組加酶，根據蛋白酶使用說明推薦劑量，試驗組蛋白酶添加量為發酵底物的0.01%，試驗組每組設3個重復。發酵終止時取樣約200g于65℃烘干，粉碎過40目篩，陰涼干燥處保存待測指標。
1.6 測定指標及方法
用溫度計測定發酵物料中心溫度，取樣用浸提法結合pH計測定鮮樣pH，初水分、粗蛋白質、粗灰分、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量參照張麗英的方法進行測定，游離氨基酸含量參照朱燕等采用的茚三酮顯色法進行測定，揮發性鹽基氮(TVBN)含量參照朱燕等采用的半微量蒸餾法測定，真蛋白質參照胡永娜等采用的三氯乙酸沉淀法測定。蛋白質分子質量參考Sadeghi等的方法，采用不連續SDS-PAGE對發酵豆粕進行蛋白質電泳。
1.7 統計分析
試驗結果使用Excel 2007進行預處理，用SPSS 19.0統計軟件對結果進行雙因素方差分析，采用Duncan氏法多重比較檢驗，結果以平均值±標準差表示(顯著水平為P＜0.05)，SDS-PAGE電泳圖譜使用Banscan(version5.0)軟件分析。
2結果與分析
2.1 豆粕發酵參數的優化
由表1可知，發酵溫度呈先上升后下降的趨勢，各料水比在發酵24h時均達到最高溫度，48h發酵溫度略高于室溫(28～29℃)，而72h發酵溫度幾乎同于室溫，說明微生物在48h后發酵作用微弱。其中料水比為1∶0.4時的發酵溫度在各時間點均為最高值，一定程度上說明其微生物最活躍且持續時間長。
發酵過程中pH緩慢下降，料水比為1∶0.4時各時間點的pH總計值顯著低于其他料水比(P＜0.05)，各料水比發酵72h時的pH總計值顯著低于其他時間點(P＜0.05)。在pH上，發酵時間與料水比交互作用顯著(P＜0.05)。
發酵過程中粗蛋白質含量呈先上升后下降趨勢。0h粗蛋白質含量在41%左右，48h各料水比組粗蛋白質含量達到最高，相對于0h分別提高了4.39、5.67、3.90和6.22個百分點，所有組中，以料水比為1∶0.6時發酵48h的粗蛋白質含量最高，達到47.29%，48h后略有下降。
發酵過程中真蛋白質含量整體呈先上升后下降趨勢，48h各料水比組真蛋白質含量均上升到最高，之后略有下降。在真蛋白質含量上，發酵時間和料水比兩因素交互作用顯著(P＜0.05)，其中料水比1∶0.4在發酵48h條件下真蛋白質含量上升最高，達到43.34%。
發酵過程中初水分含量呈緩慢升高趨勢，0～24h初水分含量上升明顯，之后變化幅度減小。1∶0.6料水比初水分含量顯著高于其他水平組(P＜0.05)。發酵過程中揮發性鹽基氮含量總體呈先升高后緩慢下降的趨勢，且隨著料水比的增加呈相應的梯度增加，其中1∶0.6料水比在發酵48h時揮發性鹽基氮含量最高，達到38.10×10－2mg/g。
綜上所述，隨著料水比的遞增，發酵豆粕的溫度、pH和真蛋白質含量都呈梯度變化，其中料水比1∶0.4組部分發酵指標優于其他組。而粗蛋白質含量指標顯示料水比1∶0.6組最優，但其發酵后揮發性鹽基氮含量過高，影響發酵豆粕商品質量。另外，1∶0.6料水比發酵后水分含量過高，極大增加了生產成本。綜合考慮后本試驗選取1∶0.4為推薦生產料水比。就發酵時間而言，初水分、粗蛋白質和真蛋白質含量在發酵48h達到最高，其后又顯著下降。溫度和pH在發酵48～72h變化幅度減小，說明發酵48h時微生物作用已很微弱。因此本試驗選取48h作為推薦發酵時間。
2.2 加酶對豆粕發酵品質的影響
2.2.1 加酶對豆粕發酵常規營養成分的影響
由表2可知，與對照組相比，試驗組粗蛋白質含量無顯著變化(P＞0.05)，而真蛋白質含量顯著降低(P＜0.05)，游離氨基酸含量提高了0.36個百分點(P＜0.05)，干物質含量降低了4.11個百分點(P＜0.05)，粗灰分、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維都略有降低，但差異不顯著(P＞0.05)。
發酵過程中pH緩慢下降，料水比為1∶0.4時各時間點的pH總計值顯著低于其他料水比(P＜0.05)，各料水比發酵72h時的pH總計值顯著低于其他時間點(P＜0.05)。在pH上，發酵時間與料水比交互作用顯著(P＜0.05)。
發酵過程中粗蛋白質含量呈先上升后下降趨勢。0h粗蛋白質含量在41%左右，48h各料水比組粗蛋白質含量達到最高，相對于0h分別提高了4.39、5.67、3.90和6.22個百分點，所有組中，以料水比為1∶0.6時發酵48h的粗蛋白質含量最高，達到47.29%，48h后略有下降。
發酵過程中真蛋白質含量整體呈先上升后下降趨勢，48h各料水比組真蛋白質含量均上升到最高，之后略有下降。在真蛋白質含量上，發酵時間和料水比兩因素交互作用顯著(P＜0.05)，其中料水比1∶0.4在發酵48h條件下真蛋白質含量上升最高，達到43.34%。
發酵過程中初水分含量呈緩慢升高趨勢，0～24h初水分含量上升明顯，之后變化幅度減小。1∶0.6料水比初水分含量顯著高于其他水平組(P＜0.05)。發酵過程中揮發性鹽基氮含量總體呈先升高后緩慢下降的趨勢，且隨著料水比的增加呈相應的梯度增加，其中1∶0.6料水比在發酵48h時揮發性鹽基氮含量最高，達到38.10×10－2mg/g。
綜上所述，隨著料水比的遞增，發酵豆粕的溫度、pH和真蛋白質含量都呈梯度變化，其中料水比1∶0.4組部分發酵指標優于其他組。而粗蛋白質含量指標顯示料水比1∶0.6組最優，但其發酵后揮發性鹽基氮含量過高，影響發酵豆粕商品質量。另外，1∶0.6料水比發酵后水分含量過高，極大增加了生產成本。綜合考慮后本試驗選取1∶0.4為推薦生產料水比。就發酵時間而言，初水分、粗蛋白質和真蛋白質含量在發酵48h達到最高，其后又顯著下降。溫度和pH在發酵48～72h變化幅度減小，說明發酵48h時微生物作用已很微弱。因此本試驗選取48h作為推薦發酵時間。
2.2 加酶對豆粕發酵品質的影響
2.2.1 加酶對豆粕發酵常規營養成分的影響
由表2可知，與對照組相比，試驗組粗蛋白質含量無顯著變化(P＞0.05)，而真蛋白質含量顯著降低(P＜0.05)，游離氨基酸含量提高了0.36個百分點(P＜0.05)，干物質含量降低了4.11個百分點(P＜0.05)，粗灰分、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維都略有降低，但差異不顯著(P＞0.05)。
2.2.2 SDS-PAGE電泳檢測蛋白質分子質量的結果
SDS-PAGE電泳檢測蛋白質分子質量的結果見圖1。
SDS-PAGE電泳圖譜使用凝膠電泳圖譜分析軟件Banscan(version5.0)掃描每個條帶的光密度，并設定40ku以下為小分子蛋白質，40～60ku為中分子蛋白質，60ku以上為大分子蛋白質。每類蛋白質的含量以該類蛋白質電泳條帶光密度占其整條泳道光條帶密度的百分數表示。不同處理豆粕蛋白質亞基分布情況見表3。
由圖1及表3可知，未發酵豆粕組大分子蛋白質含量為18.25%，發酵48h后顯著減少，其中加蛋白酶發酵豆粕組大分子含量顯著低于未發酵豆粕組和發酵豆粕組(P＜0.05)，發酵豆粕組顯著低于未發酵豆粕組(P＜0.05)。未發酵豆粕組的中分子蛋白質含量顯著高于加蛋白酶發酵豆粕組和發酵豆粕組(P＜0.05)，但經發酵的2組之間差異不顯著(P＞0.05)。小分子蛋白質含量加蛋白酶發酵豆粕組顯著高于發酵豆粕組(P＜0.05)，而發酵豆粕組顯著高于未發酵豆粕組(P＜0.05)。
3討 論
3.1 豆粕發酵參數的優化
發酵溫度、pH是微生物活躍程度的直接衡量指標，由于微生物大量繁殖，各料水比發酵溫度均在24h時最高，之后隨著底物中可利用碳水化合物等減少，微生物活性逐漸減弱，發酵溫度緩慢降低。該試驗pH緩慢下降是因為多菌種(不含乳酸菌)發酵并不會使pH大幅度下降，但較低的pH說明微生物對底物分解更徹底，產生更多的有益代謝產物。
底物初水分含量是一個重要的生產指標，隨著發酵過程的進行，微生物不斷將底物中的碳水化合物等結構支撐物質分解，造成底物稀濕粘連。由于發酵后水分含量會極大程度增加烘干成本，實際生產中常選用較低的料水比。
粗蛋白質含量是發酵豆粕的重要商品價值指標，豆粕經微生物處理后蛋白質絕對含量不變或略有下降。但由于碳水化合物被分解導致粗蛋白質含量相對上升。本試驗4個料水比發酵48h其粗蛋白質含量提高程度較相似發酵條件下陳中平等采用單一米曲霉發酵的結果略高，這可能是由于多菌種比單一米曲霉發酵能力更強。Zamora等對豆粕發酵處理后粗蛋白質含量由43.4%上升至45.4%，與本試驗結果較為一致。
真蛋白質(酸不溶蛋白)是豆粕蛋白質中未被微生物分解的部分以及菌體蛋白，而另一部分經微生物分解后形成的小肽、氨基酸及其他非蛋白氮能溶于三氯乙酸中。本試驗中真蛋白質含量呈上升趨勢，這與許多真蛋白質含量降低的報道相反，但是與陳京華利用米曲霉發酵豆粕后真蛋白質含量上升程度一致，劉穩結等利用多菌種發酵豆粕也得到真蛋白質含量升高的趨勢。其可能原因是微生物一方面將真蛋白質分解為小肽、游離氨基酸和氨氮，另一方面又將這些分解物合成菌體蛋白，加之微生物對干物質的消耗，三者相互動態作用使真蛋白質相對含量不穩定。本試驗的真蛋白質含量先升高可能是由于菌體蛋白的大量合成以及底物中碳水化合物被利用，發酵后期隨著氨基酸、小肽及非蛋白氮增加，真蛋白質含量降低。
本試驗中料水比1∶0.6組發酵后粗蛋白質含量和pH指標都優于料水比1∶0.4組，但由于料水比1∶0.6組揮發性鹽基氮含量顯著高于其他料水比組，而揮發性鹽基氮含量反映了發酵豆粕的氨基酸損失和腐敗程度，該值應越低越好，所以選擇1∶0.4為推薦發酵料水比。本試驗選取48h為推薦發酵時間，這與Sardjono等研究證明豆粕發酵48h米曲霉分泌的蛋白酶活性達到最高水平而后變弱的結論一致。
3.2 加酶對豆粕發酵品質的影響
3.2.1 加酶對豆粕發酵常規營養成分的影響
微生物對豆粕的發酵作用主要依賴于其所產生的各種酶，特別是各種蛋白酶。理論上添加外源蛋白酶協同微生物發酵豆粕能夠縮短發酵時間，產生更好的發酵效果。本試驗選取上述推薦發酵條件做加酶與不加酶發酵的對照試驗，結果顯示加蛋白酶發酵對豆粕粗蛋白質含量影響不顯著，而顯著降低了真蛋白質含量和顯著升高了游離氨基酸的含量。這說明加蛋白酶發酵使豆粕中更多的蛋白質降解為酸溶性蛋白。試驗組豆粕的干物質含量顯著降低，這可能是蛋白酶對豆粕蛋白的降解為微生物提供了更多小肽、氨基酸等容易利用的氮源物質，使微生物生長更旺盛，將更多碳水化合物分解為自身代謝提供碳架和能量。加蛋白酶使發酵豆粕中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量略有下降但不顯著，這可能是因為豆粕中纖維含量較低，該類發酵微生物對碳源的利用主要來自于淀粉、多糖等碳水化合物，而對纖維的改造程度不大。
3.2.2 加酶對豆粕發酵蛋白質分子質量的影響
豆粕中主要抗原蛋白包括大豆球蛋白、α－伴大豆球蛋白、β－伴大豆球蛋白和γ－伴大豆球蛋白。其中大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白占大豆總蛋白的70%以上，經SDS-PAGE膠電泳分離后其條帶顯示未發酵豆粕組的各抗原蛋白條帶顏色均深于加蛋白酶發酵豆粕組和發酵豆粕組。條帶光密度分析結果顯示加蛋白酶發酵豆粕組較發酵豆粕組β－伴大豆球蛋白的α亞基和α'亞基(大分子蛋白質)含量顯著降低，小分子蛋白質含量顯著提高。這說明添加蛋白酶發酵能夠有效分解豆粕中大分子蛋白質，減少抗營養因子，提高其營養價值。
4結 論
① 利用復合益生菌( 釀酒酵母∶ 米曲霉∶ 枯草芽孢桿菌= 5∶1∶2) ，模擬工廠生產的發酵條件，綜合考慮生產成本因素，選取料水比1 ∶ 0.4、發酵48 h為發酵豆粕生產的推薦工藝參數。
② 在推薦發酵條件下添加外源蛋白酶協同微生物發酵可進一步改善發酵豆粕蛋白質品質，顯著降低抗營養因子含量，提高發酵豆粕可利用氮的質量。
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