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近年來, 隨著人們對飼用抗生素帶來的負面效應的認識愈加深入, 我國在養殖業中規定允許使用的飼用抗生素的種類越來越少, 并且, 禁用飼用抗生素已是大勢所趨。因此, 研發飼用抗生素的替代品成為動物營養領域的一個研究熱點。發酵飼料作為一類新型、綠色、環保的飼料, 由于其在生產過程中微生物發酵可以產生大量有益于動物健康的代謝產物, 因而其可以在一定程度上減少養殖過程中飼用抗生素的使用, 從而降低養殖成本。因此, 在畜牧生產中, 發酵飼料的研發與推廣備受關注。近年來, 諸多研究顯示, 在動物生產中使用發酵飼料可維持動物消化道微生態平衡、增強動物的免疫力、提高生長性能。然而, 當前有關發酵飼料在豬生產中的研究仍主要集中于發酵飼料對豬生長性能等表型指標的影響, 關于發酵飼料對豬機體整體代謝影響的報道極少, 對豬肉品質的影響仍不十分清楚。因此, 本試驗擬采用基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜的代謝組學技術, 研究發酵飼料對生長育肥豬血清代謝產物的影響, 同時探討飼喂發酵飼料對育肥豬生長性能、胴體性狀、肉品質、血清生化指標的影響, 擬為發酵飼料在豬生產中的合理應用提供相關試驗數據。

1.1 試驗動物、試驗飼糧與試驗設計

試驗選用健康、日齡基本一致, 體重約60 kg的三元雜交豬24頭, 隨機分為2組, 分別為基礎飼糧組 (對照組) 和發酵飼料組 (試驗組) , 每組4個重復, 每個重復3頭豬。對照組飼喂基礎飼糧, 試驗組飼喂80%基礎飼糧和20%發酵飼料 (發酵飼料底物組成同基礎飼糧) 。基礎飼糧組成及營養水平見表1。

發酵飼料的制作程序如下:采用南京農業大學動物科技學院消化道微生物實驗室保存的唾液乳桿菌L79、枯草芽孢桿菌B1121和釀酒酵母菌S1145制備菌液, 并按照質量比2∶2∶1進行混合 (復合菌總數量約為1×10⁹CFU/g) , 取對照組基礎飼糧, 按0.2%復合菌液添加于飼糧中, 混合均勻后分裝至發酵袋中, 于37℃發酵2 d, 飼喂前再與基礎飼糧以1∶4的比例混合, 將混合后的飼料作為試驗組飼糧。試驗期間, 每日飼喂2次, 自由采食, 自由飲水。預試期6 d, 正試期29 d。

1.2 樣品采集

正式試驗開始后第30天, 將試驗豬禁飼12 h后稱重, 禁飼期間自由飲水。隨后, 每個重復隨機選取1頭豬, 頸靜脈采血, 室溫放置20 min后3 000 r/min離心10 min分離血清, -20℃保存;每組選取4頭接近平均體質量的豬, 按照常規流程進行屠宰, 檢驗檢疫后測定胴體性狀指標, 并取200 g左右的背最長肌樣品, 存于4℃冰盒中, 用于肉品質測定。

1.3 檢測指標

1.3.1 生長性能和胴體性狀指標測定

試驗開始和結束時對試驗豬進行稱重, 記錄試驗豬的采食量, 計算平均日采食量、平均日增重和料重比。

參照NY/T 825—2004《瘦肉型豬胴體性狀測定技術規范》測定育肥豬胴體重、屠宰率、背膘厚。

1.3.2 背最長肌肉品質指標測定

背最長肌pH_{45 min}、pH_24 h、亮度 (L*) 值、紅度 (a*) 值、黃度 (b*) 值、滴水損失、蒸煮損失和剪切力的測定參照NY/T 2793—2015《肉的食用品質客觀評價方法》。按照美版NPPC比色板進行肉色評分和大理石紋評分。

1.3.3 背最長肌營養成分測定

利用凱氏定氮法和索氏提取法測定背最長肌樣品中粗蛋白質、粗脂肪、干物質含量。

1.3.4 血清生化指標測定

采用南京生物工程研究所試劑盒測定育肥豬血清總蛋白 (TP) 、尿素氮 (UN) 、甘油三酯 (TG) 、總膽固醇 (TC) 、葡萄糖 (GLU) 含量及谷丙轉氨酶 (ALT) 、谷草轉氨酶 (AST) 活性。

1.3.5 血清代謝產物組成測定

取100μL血清置于1.5 mL離心管中, 加0.3 mL甲醇, 10μL內標 (2-氯苯丙氨酸) , 渦旋30 s, 在4℃、12 000 r/min離心10 min, 移取200μL上清, 轉入自動進樣瓶。采用基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜的代謝組學技術, 對血清進行色譜分離和鑒定, 并測定標志性差異代謝產物含量。

1.4 數據統計與分析

采用Waters Masslynx V4.1軟件對原始數據進行峰檢測和峰匹配。每個樣本的總峰面積歸一化至10000。采用有監督的偏最小二乘判別分析 (partial least-square discriminant analysis, PLS-DA) 方法對樣品進行模式識別分析。潛在標志物根據變異權重參數值 (VIP) 、置信區間得分圖 (scoring plot) 和載荷圖 (loading plot) 進行篩選, 用SPSS20.0進行獨立樣品t檢驗 (independent-sample t test) 方法分析, 再根據VIP和統計結果進行判別分析。血清生化指標等數據以平均值和標準誤的形式表示, 試驗所得數據經Excel 2010初步處理后, 采用SPSS 20.0軟件中的獨立樣本t檢驗方法進行分析, P<0.05為達到顯著性水平。

2結 果

2.1 發酵飼料中營養成分的變化

由表2可知, 發酵飼料中粗蛋白質、粗纖維含量及干物質消失率高于基礎飼糧 (P>0.05) , 粗脂肪含量低于基礎飼糧 (P>0.05) 。

本試驗期間, 2組育肥豬的生長性能和胴體性狀雖無顯著差異, 但飼喂發酵飼料的試驗組育肥豬的料重比在數據上低于對照組, 宰前活重、胴體重、屠宰率、眼肌面積在數據上均高于對照組, 并且背膘厚較低。導致該結果的原因可能是與試驗豬處于生長發育后期有關, 此時, 育肥豬采食量大, 外源添加物難以在短時間內有效地改變其生長速度, 此外, 本研究所用豬的數量相對較少。因此, 有關發酵飼料對豬的生長性能的影響還需進一步研究。

動物血清生化指標可反映動物的生理代謝和健康情況。血清中的總蛋白在維持血管內膠體滲透壓、運輸養分等功能中具有重要的作用, 可反映機體本身的營養狀況和對蛋白質的消化吸收情況。血清中的總蛋白含量越高, 表明機體合成蛋白質的能力越強。本試驗中, 試驗組育肥豬血清中總蛋白含量顯著高于對照組, 說明豬的蛋白質合成能力增強。尿素氮是機體蛋白質和氨基酸等組分的代謝產物, 其含量可相對準確地反映出動物體內蛋白質代謝和氨基酸代謝的平衡。本試驗中, 試驗組育肥豬血清中尿素氮含量顯著高于對照組, 說明飼喂發酵飼料促進機體蛋白質的分解代謝。由此, 基于飼喂發酵飼料組育肥豬血清中總蛋白和尿素氮含量皆高于對照組, 本試驗認為發酵飼料可能促進了機體蛋白質整體代謝, 這也可能是2組豬的生長性能沒體現出差異的原因之一。

本研究利用代謝組學研究手段, 研究發現飼喂發酵飼料顯著影響了育肥豬血清中L-焦谷氨酸、黃嘌呤、丁子香酚、丙烯酰胺和對-香豆酸含量。在這些代謝產物中, L-焦谷氨酸是谷胱甘肽的分解產物之一, 血清中L-焦谷氨酸含量下降, 說明飼喂發酵飼料可在一定程度上降低谷胱甘肽的分解代謝, 此結論與前文所述發酵飼料可增強育肥豬機體蛋白質整體代謝這一結論相符。研究發現, 谷胱甘肽可減少蛋白巰基被氧化導致的酶失活, 并可與體內自由基結合加速其向酸類物質的還原過程, 因而其可減輕自由基對機體重要臟器的損傷。由此, 谷胱甘肽分解代謝減弱對維持機體健康有著積極作用。本試驗中育肥豬血清代謝產物中的對-香豆酸與丁子香酚主要來自于微生物發酵飼料生成, 與對照組相比, 其在試驗組的育肥豬血清中含量升高, 原因可能與飼料發酵生成有關。相關研究表明, 對-香豆酸與丁子香酚均具有良好的抗氧化活性, 上述物質含量上升暗示發酵飼料具有增強育肥豬抗氧化應激的作用。本研究中, 飼喂發酵飼料的育肥豬血清中的丙烯酰胺和黃嘌呤含量上升, 出現該結果的具體原因尚不清楚。

肉色是影響豬肉感官的重要指標。研究表明, 飼喂發酵飼料可使豬肉肉色更加鮮艷。本試驗中, 試驗組育肥豬背最長肌a*值、肉色評分顯著高于對照組, 原因可能與試驗組育肥豬血清中的對-香豆酸、丁子香酚含量增多和機體谷胱甘肽代謝降低有關。如前所述, 對-香豆酸與丁子香酚具有抗氧化活性, 能夠抑制細胞膜脂質的過氧化反應, 從而延緩肌肉中肌紅蛋白被氧化為導致肉色變暗的高鐵血紅蛋白。因此試驗組的育肥豬血清中對-香豆酸與丁子香酚含量升高, 暗示發酵飼料具有提高肉的色澤和亮度及改善肉色的功能。嫩度是豬肉口感的重要物理指標, 是豬肉質地的反映, 而剪切力是評定肌肉嫩度的客觀指標, 其平均剪切力越高, 肉越老。有研究表明, 嫩度與豬背最長肌內脂肪含量和肉的保水量相關, 肉的保水性增加可減少汁液損失, 從而提高嫩度。相關研究表明, 育肥豬飼糧中添加發酵飼料可有效改善豬肉品質, 提高肌內脂肪含量, 顯著降低背最長肌的剪切力值。本試驗結果顯示, 試驗組育肥豬背最長肌中脂肪含量顯著高于對照組, 且蒸煮損失低于對照組, 剪切力也顯著低于對照組, 結果也與上述文獻報道相符。造成上述結果的原因可能是飼喂發酵飼料增強了機體抗氧化能力, 進而增強了機體的抗應激能力, 從而使屠宰后背最長肌細胞中糖酵解速度減慢, 進而導致其pH下降速度顯著慢于對照組。研究顯示, 較慢的pH下降速度可降低肌紅蛋白、肌動蛋白等蛋白質的變性程度, 從而使肌肉色澤更加鮮艷、嫩度提升、系水力增強, 該結果也暗示發酵飼料可能具有改善肌肉的食用品質的功能。