2.2 不同中性蛋白酶對(duì)豆粕中抗原蛋白降解效果的比較

利用不同中性蛋白酶對(duì)豆粕進(jìn)行處理，通過對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)各中性蛋白酶對(duì)豆粕中兩類抗原蛋白的降解效果，結(jié)果如圖2所示，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定條件下(試驗(yàn)方法1.2.2)，各中性蛋白酶酶制劑對(duì)豆粕的抗原蛋白降解程度具有差異，5號(hào)中性蛋白酶在此條件下對(duì)抗原蛋白降解效率較高，其工作濃度為0.2%(m/m)。

2.3 不同蛋白酶配比劑量對(duì)豆粕抗原蛋白降解程度的比較

將上文挑選出的兩種蛋白酶按照如圖 3 所示的質(zhì)量比例進(jìn)行混合，在微生物存在條件下（試驗(yàn)方法1.2.3，GJ25 及 BS01 在達(dá)到菌液濃度要求后,每 100 g豆粕添加1 ml菌液）發(fā)酵48 h后提取蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3。

通過膠圖分析軟件UVP-VisionWorks對(duì)圖3(a)中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的條帶進(jìn)行定量分析，并將未經(jīng)處理的豆粕對(duì)照樣品中的對(duì)應(yīng)條帶設(shè)定為100%，計(jì)算其他各試驗(yàn)組相關(guān)條帶的相對(duì)含量，得到圖3(b)的結(jié)果。結(jié)果顯示，酸性蛋白酶與中性蛋白酶的混合作用可降解豆粕中大于60%的兩類抗?fàn)I養(yǎng)因子。其中，酸性蛋白酶與中性蛋白酶的比例在1：1至1：5內(nèi)降解效果達(dá)到最優(yōu)，最終確定比例為1：1時(shí)較為合理，兩者工作濃度均為0.2%。

2.4 發(fā)酵時(shí)間的確定

利用 5 號(hào)酸性蛋白酶與 5 號(hào)中性蛋白酶 1：1 配比的酶制劑，在微生物存在條件下（試驗(yàn)方法1.2.4）對(duì)豆粕進(jìn)行處理，在72 h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)采集樣品并進(jìn)行對(duì)應(yīng)的電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4。

圖4可見，豆粕中兩種抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解效果隨時(shí)間增長(zhǎng)而提高，在 48 h時(shí)達(dá)到最高，與 72 h發(fā)酵效果無(wú)明顯差異，因此選定利用上文所述兩種酶制劑1 ：1配比的菌酶協(xié)同發(fā)酵時(shí)間為48 h。

2.5 發(fā)酵效果評(píng)價(jià)

依據(jù)上述結(jié)果，參考本試驗(yàn)所用條件（試驗(yàn)方法1.2.3 及 1.2.4）最終確定了發(fā)酵條件為：5 號(hào)酸性蛋白酶0.2%，5號(hào)中性蛋白酶0.2%，1%（v/m）枯草芽孢桿菌BS01（菌液濃度為1×106 CFU/ml），1%（v/m）植物乳桿菌 GJ25（菌液濃度為 1×109 CFU/ml），發(fā)酵時(shí)間 48 h。對(duì)在該條件下得到的發(fā)酵豆粕進(jìn)行部分指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果如表1所示。

表1結(jié)果表明，本文確定的發(fā)酵劑及發(fā)酵條件下，發(fā)酵豆粕的粗蛋白及其中酸溶蛋白含量較高，提示其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。大豆球蛋白含量較低，提示該產(chǎn)品對(duì)豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子降解效果較好。產(chǎn)品pH值較低，乳酸含量較高可幫助維持動(dòng)物腸道環(huán)境。另外，該產(chǎn)品還對(duì)水蘇糖和棉籽糖兩類抗?fàn)I養(yǎng)因子降解效果明顯。

3、討論

發(fā)酵豆粕是解決豆粕在動(dòng)物飼喂過程中消化利用率低下的重要手段之一，生產(chǎn)發(fā)酵豆粕需要根據(jù)原料特點(diǎn)選擇適合的條件及發(fā)酵劑。目前發(fā)酵豆粕生產(chǎn)所采用的發(fā)酵劑包含酶制劑和微生物。其中針對(duì)蛋白質(zhì)降解起主要作用的是蛋白酶制劑。目前市

場(chǎng)上酶制劑種類繁多，但是大部分酶制劑的最適條件與實(shí)際生產(chǎn)條件存在差異。在對(duì)酶制劑進(jìn)行選擇的時(shí)候不能僅憑酶活力大小作為判斷依據(jù)，而應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注針對(duì)目標(biāo)底物的特異性效果。

本試驗(yàn)針對(duì)降解豆粕中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子大豆球蛋白及 β-伴大豆球蛋白這一目的，從挑選在非最適條件下適于降解豆粕的酶制劑入手，通過調(diào)整菌劑及酶制劑的配比，實(shí)現(xiàn)了較小成本下生產(chǎn)具有較高品質(zhì)的發(fā)酵豆粕。依據(jù)蛋白酶制劑的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T23527—2009），固體蛋白酶產(chǎn)品的活力單位定義為：1 g固體酶粉，在一定溫度和pH值條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生 1 μg 酪氨酸，即為一個(gè)酶活力單位，以U/g 表示。在發(fā)酵豆粕生產(chǎn)過程中，為保證益生菌的增殖及活性，其發(fā)酵過程中的溫度變化及 pH 值變化很難保證蛋白酶處在其最適條件。因此酶制劑產(chǎn)品所標(biāo)示的酶制劑活力并不能反映出其對(duì)不同底物如豆粕中大豆蛋白的降解程度。本研究結(jié)果表明，不同來(lái)源的酶制劑在酪蛋白水解能力一致的條件下，針對(duì)特定原料豆粕的降解效果存在差異。同時(shí)中性蛋白酶對(duì)豆粕的降解起到更主要的作用，這一結(jié)果也同前人研究結(jié)果一致，綜合考慮成本因素和豆粕降解效果，本研究最終確定了上述酶制劑配比比例及發(fā)酵條件。需要說(shuō)明的是，由于是隨機(jī)盲選，酸性蛋白酶和中性蛋白酶的最優(yōu)組編號(hào)均為 5號(hào)，但是兩者并不來(lái)自同一廠家。另外，本試驗(yàn)所用豆粕均為自然顆粒大小，沒有經(jīng)過粉碎處理，也沒有滅菌處理，這些條件也是考慮到目前大部分發(fā)酵豆粕生產(chǎn)廠家的實(shí)際情況，盡量簡(jiǎn)化發(fā)酵的條件控制，具體發(fā)酵條件在實(shí)際生產(chǎn)中也可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行微調(diào)。同時(shí)，本研究針對(duì)特定原料進(jìn)行酶制劑篩選的思路和方法，也為實(shí)際生產(chǎn)中如何選擇合適的發(fā)酵劑產(chǎn)品提供了新的參考方案。

4、結(jié)論

本研究通過對(duì)酶制劑及酶制劑配比進(jìn)行篩選，確定了菌酶協(xié)同發(fā)酵中一套最適的發(fā)酵條件，適合發(fā)酵豆粕生產(chǎn)。得到的發(fā)酵豆粕產(chǎn)品中，粗蛋白含量50.86%，酸溶蛋白 14.76%，大豆球蛋白 25.3 mg/g，pH 值 4.5，乳酸含量 2.76%，水蘇糖含量 0.017%，棉籽糖含量 0.082%。該產(chǎn)品抗?fàn)I養(yǎng)因子低、乳酸含量高，是有益動(dòng)物腸道健康的發(fā)酵豆粕產(chǎn)品，并能較大程度節(jié)約成本。

豆粕發(fā)酵方法

1.準(zhǔn)備優(yōu)質(zhì)豆粕1噸、99多功能飼料發(fā)酵劑1-2包（500克，市場(chǎng)售價(jià)25元左右，第一次制作和低溫季節(jié)使用量大）、多糖性復(fù)合菌種培養(yǎng)基5公斤。

2.先將多糖性復(fù)合菌種營(yíng)養(yǎng)基融入低于45℃的溫水中再加入99多功能飼料發(fā)酵劑發(fā)酵劑，2小時(shí)以上后再與上述其它物料混合均勻后將含水量調(diào)節(jié)到50%-60%（手捏一把成團(tuán)且沒有水滴下為宜），本方法也用于發(fā)酵菜粕、棉粕脫毒代替豆粕。

3.最后壓實(shí)密封裝袋發(fā)酵7-10天即可打開使用，打開使用時(shí)切記要重新密封好，防止雜菌進(jìn)入造成發(fā)霉。

密封發(fā)酵中的豆粕

多糖性復(fù)合菌種營(yíng)養(yǎng)基產(chǎn)品說(shuō)明書

本產(chǎn)品是針對(duì)復(fù)合微生物制劑產(chǎn)品（益生菌、菌種）進(jìn)行激活、擴(kuò)培、發(fā)酵等針對(duì)性設(shè)計(jì)的專用營(yíng)養(yǎng)包（培養(yǎng)基），以菌種更喜歡的“食物”高濃度糖蜜為主要原料，再科學(xué)地添加氮源等原料，形成菌種“食物的全價(jià)飼料”，讓激活、培養(yǎng)、擴(kuò)培的菌種更健壯與密度更大，讓發(fā)酵飼料效果與質(zhì)量更好，讓直接添加的益生菌產(chǎn)生效果更快更好。且運(yùn)用成本低廉，本品1公斤使用效果多項(xiàng)指標(biāo)比添加3公斤紅糖、葡萄糖、白糖效果更好。在制作發(fā)酵飼料時(shí)本品1公斤可以直接代替20公斤左右的玉米粉等且在許多參數(shù)上發(fā)酵效果更好更快更香醇。

本產(chǎn)品符合飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)

【適用對(duì)象】畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖，環(huán)保

【原料組成】多糖性糖蜜、植物性蛋白胨、酵母膏、微量元素、維生素等。

【產(chǎn)品成分分析保證值】本品為黏稠液體，總糖分（蔗糖分+還原糖分）≥48%。 

【產(chǎn)品特點(diǎn)】

1.本品為運(yùn)用在畜禽與水產(chǎn)養(yǎng)殖上、環(huán)保上經(jīng)常使用的復(fù)合微生物（菌種）生長(zhǎng)、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料，含有微生物（菌種）所必需的碳源、氮源、微量元素、生長(zhǎng)素等。

2.本品運(yùn)用高濃度甘蔗糖蜜為主要原料，輔以低聚糖（益生元）等復(fù)合菌種所需的營(yíng)養(yǎng)而設(shè)計(jì)，因此制作出的菌種健壯與密度更大、發(fā)酵飼料等氣味甜香濃郁，對(duì)飼養(yǎng)動(dòng)物而言適口性更好。

【產(chǎn)品使用方法】

一、制作加強(qiáng)型EM菌液上的使用

將本品先溶于5倍以上的溫水中（溫度不超過45℃），再另外添加菌種和實(shí)際用水量（按照EM菌種的產(chǎn)品說(shuō)明書），按照本品1公斤代替約3公斤紅糖的使用量，當(dāng)然也可以少量另外添加少量紅糖或者適當(dāng)增加本品的使用量效果更好。

二、激活多種復(fù)合菌種的使用方法

將本品溶于少量低于45℃的溫水中后再放入需要激活的菌種，然后再加入適量的水。適當(dāng)增加本品的使用量會(huì)增加菌種的健壯程度與密度，且保存的時(shí)間也可以更長(zhǎng)。本品1公斤可以兌水50公斤以上適合激活各種需要激活的復(fù)合菌種，廣泛運(yùn)用包括糞污處理菌種激活、環(huán)保處理菌種激活、動(dòng)物飲水復(fù)合益生菌激活后使用等運(yùn)用上。

三、發(fā)酵飼料制作上的使用

先將本品融入低于45℃的溫水中再加入發(fā)酵劑，2小時(shí)以上后再與飼料混合，能夠大幅度提高發(fā)酵飼料的速度、質(zhì)量、營(yíng)養(yǎng)和適口性（包括青貯飼料），每噸發(fā)酵飼料添加本品推薦在750克以上，原則上本品使用量越大效果越好。本品1公斤可以代替20公斤左右的玉米粉制作發(fā)酵飼料且發(fā)酵效果更好更快更香醇（包括青貯飼料），運(yùn)用本品后可以減少或不使用玉米粉，顯著降低發(fā)酵飼料制作成本。

四、配合畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌使用

先將本品融入低于45℃的溫水中，再將運(yùn)用在畜禽與水產(chǎn)養(yǎng)殖上的益生菌（不管是水劑還是粉劑）溶于其中2小時(shí)以上進(jìn)行活化再使用（直接拌料或者飲水中添加），將可以明顯提高使用效果。使用量按照每噸飼料或飲水使用本品200克以上進(jìn)行，活化后要求在72小時(shí)內(nèi)使用完。此項(xiàng)操作也適合動(dòng)物因?yàn)閾Q欄等因素導(dǎo)致的應(yīng)激，能夠讓動(dòng)物快速恢復(fù)食欲，減少腸道健康等問題。

五、改善草料、青料等適口性

稀釋后（至少30倍）灑入一些動(dòng)物飼料上（如草料、青綠飼料、適口性差的飼料等）能夠明顯改善采食量，提高營(yíng)養(yǎng)和吸收等，稀釋時(shí)加入對(duì)應(yīng)動(dòng)物的益生菌效果更好。

六、其它方面的使用

在畜禽與水產(chǎn)養(yǎng)殖上，可以將本品作為特殊的甜味劑，改善因?yàn)樘砑幽承┧幬飳?dǎo)致適口性差動(dòng)物不吃的問題；直接將本品溶解稀釋后灑入水產(chǎn)養(yǎng)殖水域能夠促進(jìn)微生物繁殖；灑入糞污處理中能夠促進(jìn)發(fā)酵等；灑入采用微生物處理的污水中能夠加快處理速度等效果。

發(fā)酵豆粕的好處

1. 發(fā)酵豆粕徹底去除了大豆抗原和抗?fàn)I養(yǎng)因子，解決幼齡動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)性腹瀉問題；
2. 低溫烘干或直接飼喂的濕潤(rùn)狀態(tài)的發(fā)酵豆粕具有乳酸菌等益生菌功能，顯著提高動(dòng)物的健康水平，減少畜禽舍氨味臭味，提高飼料報(bào)酬；
3. 具有酸化劑的功能，可酸化腸道，激活幼齡動(dòng)物消化酶活性，抑制有害細(xì)菌；
4. 含較高的活性小肽，可以通過腸道粘膜直接吸收，吸收耗能低，并顯著提高植物蛋白的利用率；
5. 發(fā)酵后的豆粕適口性好，提高動(dòng)物食欲，促進(jìn)消化吸收，增進(jìn)健康水平。

使用對(duì)象及用法用量

添加比例可以依據(jù)飼養(yǎng)對(duì)象、飼養(yǎng)階段和生理狀態(tài)的不同需求（泌乳，抗應(yīng)激，促生長(zhǎng)等），決定使用量：

1、全部替代乳清粉、代乳粉；

2、全部替代魚粉，且無(wú)組胺、無(wú)肌胃糜爛素；無(wú)高酸價(jià)；無(wú)高過氧比值；

3、全部取代腸膜蛋白粉及40%的血漿蛋白粉，且無(wú)病菌污染的危險(xiǎn)；

4、優(yōu)于豆粕等所有的植物性蛋白源。

動(dòng)物用量：乳豬10%-25%；中大豬5%-8%；種蛋禽10%-20%；淡水魚5%-15%；仔豬5%-15%；哺乳母豬5%-10%；肉小禽5%-10%；鱖鱉海水魚10%-20%；懷孕母豬5%-8%；牛羊5%-15%；蝦蟹鰻10%-25%。

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綜上所述，發(fā)酵豆粕作為一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)飼料，可改善大豆的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，降低抗?fàn)I養(yǎng)因子和抗原蛋白的水平，且富含生物活性物質(zhì)，具有促進(jìn)生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫力和抑制消化道疾病、減少抗生素用量等功能，這對(duì)斷奶仔豬而言十分重要，并有利于豆粕的高效利用，對(duì)緩解我國(guó)優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料的不足、減少對(duì)動(dòng)物蛋白質(zhì)飼料的依賴及降低生產(chǎn)成本等具有重要意義。

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多糖性復(fù)合菌種營(yíng)養(yǎng)基，大幅度提高菌種活性與使用效果，降低發(fā)酵飼料成本與提高品質(zhì)

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