2.1 基料制備實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

在基料制備過程中，為使啤酒酵母和乳酸菌始終保持最佳生長狀態(tài)，固定發(fā)酵時(shí)間為5d，通過Plactett-Burman實(shí)驗(yàn)選取顯著影響基料總菌落數(shù)的4個(gè)因素(仁渣目數(shù)、菌料比、發(fā)酵溫度、含水量)設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)。

2.1.1.1 仁渣目數(shù)的影響

在菌料比(質(zhì)量比，下同)1∶80，發(fā)酵溫度28℃，含水量30%，棕櫚仁渣目數(shù)分別為10、20、40、60、80目條件下，測定基料中總菌落數(shù)，分析仁渣目數(shù)對啤酒酵母和乳酸菌發(fā)酵棕櫚仁渣的影響，結(jié)果見圖1。注:圖中相同字母表示總菌落數(shù)之間差異不顯著(P＞0.05)，不同字母表示差異顯著(P＜0.05)，下同。圖1仁渣目數(shù)對總菌落數(shù)的影響由圖1可知，當(dāng)棕櫚仁渣目數(shù)在10～60目時(shí)，基料中總菌落數(shù)隨著棕櫚仁渣目數(shù)增大而顯著增多(P＜0.05)，當(dāng)棕櫚仁渣目數(shù)在60～80目時(shí)，基料中總菌落數(shù)隨著棕櫚仁渣目數(shù)增大而顯著降低(P＜0.05)，這可能是由于當(dāng)棕櫚仁渣目數(shù)為60目時(shí)，啤酒酵母和乳酸菌與棕櫚仁渣有效接觸面積趨于最大，隨后棕櫚仁渣因自重影響發(fā)生粘黏，有效接觸面積減少，啤酒酵母和乳酸菌無法充分利用棕櫚仁渣營養(yǎng)物質(zhì)生長發(fā)酵。故棕櫚仁渣目數(shù)選擇60目為宜。

2.1.1.2 菌料比的影響

在仁渣目數(shù)60目，發(fā)酵溫度28℃，含水量30%，菌料比分別為1∶80、1∶90、1∶100、1∶110、1∶120條件下，測定基料中總菌落數(shù)，分析菌料比對啤酒酵母和乳酸菌發(fā)酵棕櫚仁渣的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，當(dāng)菌料比在1∶80～1∶100時(shí)，基料中總菌落數(shù)隨著菌料比的增大呈顯著增加趨勢(P＜0.05)，繼續(xù)增大菌料比，總菌落數(shù)顯著降低(P＜0.05)，這可能是棕櫚仁渣營養(yǎng)物質(zhì)已被啤酒酵母和乳酸菌分解利用完畢，微生物細(xì)胞停止生長甚至開始死亡所造成的結(jié)果。因此，菌料比選擇1∶100為宜。

2.1.1.3 發(fā)酵溫度的影響

在仁渣目數(shù)60目，菌料比1∶100，含水量30%，發(fā)酵溫度分別為24、26、28、30、32℃條件下，測定基料中總菌落數(shù)，分析發(fā)酵溫度對啤酒酵母和乳酸菌發(fā)酵棕櫚仁渣的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵溫度在24～30℃時(shí)，基料中總菌落數(shù)隨著發(fā)酵溫度的上升呈顯著增加趨勢(P＜0.05)，繼續(xù)升高發(fā)酵溫度，總菌落數(shù)略有降低(P＞0.05)，這是因?yàn)殡S著溫度的升高酶反應(yīng)速度加快，啤酒酵母和乳酸菌細(xì)胞生長代謝加快，當(dāng)溫度高于30℃時(shí)酶失活速率大于微生物細(xì)胞生長代謝速率，導(dǎo)致微生物細(xì)胞衰老加快。故發(fā)酵溫度選擇30℃為宜。

2.1.1.4 含水量的影響

在仁渣目數(shù)60目，菌料比1∶100，發(fā)酵溫度30℃，含水量分別為30%、35%、40%、45%、50%條件下，測定基料中總菌落數(shù)，分析含水量對啤酒酵母和乳酸菌發(fā)酵棕櫚仁渣的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，當(dāng)含水量由30%增至35%時(shí)，基料中的總菌落數(shù)隨著含水量的增大而顯著增加(P＜0.05)，隨著含水量的繼續(xù)增加，總菌落數(shù)呈逐漸降低趨勢(P＜0.05)，這可能是由于適宜的含水量使得棕櫚仁渣的細(xì)小顆粒之間存在一定的空隙和合適的疏松度，有利于微生物進(jìn)入，在增大微生物與棕櫚仁渣表面接觸面積的同時(shí)排出微生物菌體代謝所產(chǎn)生的CO2，促進(jìn)微生物菌體生長。故含水量選擇35%為宜。

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.1.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用中心組合設(shè)計(jì)原理，以仁渣目數(shù)(A)、菌料比(B)、發(fā)酵溫度(C)和含水量(D)為響應(yīng)變量，基料中總菌落數(shù)為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平見表2，Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

利用Design Expert10.0.4軟件對表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到總菌落數(shù)對仁渣目數(shù)、菌料比、發(fā)酵溫度和含水量的二次多項(xiàng)式回歸方程:總菌落數(shù)=7.35+0.22A+1.22B+0.41C+0.28D+0.011AB-0.002AC-0.12AD+0.015BC-0.18BD-0.017CD-0.13A2-3.86B2-1.29C2-0.72D2。

該模型的分析結(jié)果及模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見表4。

由表4可知，二次回歸模型F值為154.690，P＜0.0001，表明模型極顯著。失擬項(xiàng)P=0.3088＞0.05，失擬項(xiàng)差異不顯著，說明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均可用此回歸模型描述，未知因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很小。模型決定系數(shù)R2=0.9936，說明99.36%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)變異性均可用此回歸模型解釋，模型可信度較高，該方程能很好地與實(shí)際情況擬合，較好地反映了基料中總菌落數(shù)與仁渣目數(shù)、菌料比、發(fā)酵溫度和含水量之間的關(guān)系，因此該回歸方程可較好預(yù)測總菌落數(shù)隨各參數(shù)的變化規(guī)律。校正系數(shù)R2Adj=0.9872，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果有98.72%受各因素的影響。綜上所述，該模型可用于總菌落數(shù)分析和預(yù)測。通過表4中F值可判斷各自變量對因變量的影響依次為B＞C＞D＞A，即菌料比對總菌落數(shù)的影響最大(P＜0.01)，其次為發(fā)酵溫度(P＜0.01)、含水量(P＜0.01)和仁渣目數(shù)(P＜0.01)。由回歸方程和方差分析可知，二次項(xiàng)中B2、C2、D2對總菌落數(shù)的影響達(dá)極顯著水平(P＜0.01)。

2.1.2.2 工藝條件的優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合回歸模型，預(yù)測基料制備的最佳工藝條件為棕櫚仁渣目數(shù)75.92目、菌料比1∶103.14、發(fā)酵溫度30.81℃、含水量35.53%，此條件下總菌落數(shù)為7.58×1010個(gè)/g。

2.1.2.3 模型驗(yàn)證

為了驗(yàn)證響應(yīng)面模型的可預(yù)見性，同時(shí)為了簡化實(shí)驗(yàn)操作，將基料制備工藝的最佳發(fā)酵條件修正為棕櫚仁渣目數(shù)70目、菌料比1∶103、發(fā)酵溫度30℃、含水量36%，該條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，總菌落數(shù)達(dá)到7.2×1010個(gè)/g，RSD為4.42%，與模型預(yù)測值誤差為5.01%。經(jīng)SPSS下ANOVA分析，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)總菌落數(shù)與預(yù)測總菌落數(shù)差異不顯著(P=0.056＞0.05)。說明該模型可以有效預(yù)測基料制備過程中的總菌落數(shù)，優(yōu)化結(jié)果可靠，可用來指導(dǎo)啤酒酵母和乳酸菌對棕櫚粕渣的發(fā)酵工藝。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

在產(chǎn)物發(fā)酵過程中，為使發(fā)酵產(chǎn)物的營養(yǎng)成分歸一值達(dá)到最好，固定發(fā)酵溫度為30℃，棕櫚果渣與空果串配比為1∶2。通過Plactett-Burman實(shí)驗(yàn)選取顯著影響發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值的4個(gè)因素(棕櫚果渣及空果串的粉碎長度(以下簡稱粉碎長度)、基料與棕櫚果渣和空果串配料比(以下簡稱配料比)、含水量、發(fā)酵時(shí)間)設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)。

2.2.1.1 粉碎長度的影響

在配料比1∶8(質(zhì)量比，下同)，含水量30%，發(fā)酵時(shí)間30d，粉碎長度分別為1、3、5、7、9cm條件下，測定發(fā)酵產(chǎn)物OD值，分析粉碎長度對發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分的影響，結(jié)果見圖5。

 

由圖5可知，當(dāng)粉碎長度在1～5cm時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值隨粉碎長度的增長而呈顯著增加趨勢(P＜0.05)，繼續(xù)增長粉碎長度，營養(yǎng)成分OD值開始顯著降低(P＜0.05)，這說明棕櫚果渣和空果串粉碎長度過長，會致使其與基料混合不均勻，從而影響啤酒酵母和乳酸菌對棕櫚果渣和空果串的發(fā)酵。故粉碎長度選擇5cm為宜。

2.2.1.2 配料比的影響

在粉碎長度5cm，含水量30%，發(fā)酵時(shí)間30d，配料比分別為1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12條件下，測定發(fā)酵產(chǎn)物OD值，分析配料比對發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，當(dāng)配料比在1∶8～1∶10時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值隨配料比的增大而呈顯著增加趨勢(P＜0.05)，繼續(xù)增大配料比，營養(yǎng)成分OD值顯著降低(P＜0.05)，這說明配料比過小，會致使菌落數(shù)劇增過快，從而產(chǎn)生過多的代謝廢物，導(dǎo)致菌種容易衰老，不利于發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分的提高，配料比過大，總菌落增長緩慢，培養(yǎng)時(shí)間長，使發(fā)酵周期延長，導(dǎo)致發(fā)酵成本的提升，同時(shí)會降低菌種活力，從而使菌種降解底物能力下降，營養(yǎng)成分含量降低。配料比為1∶10時(shí)，既能保證合理縮短發(fā)酵周期，又能得到較高的營養(yǎng)成分含量。故配料比選擇1∶10為宜。

2.2.1.3 含水量的影響

在粉碎長度5cm，配料比1∶10，發(fā)酵時(shí)間30d，含水量分別為25%、30%、35%、40%、45%條件下，測定發(fā)酵產(chǎn)物OD值，分析含水量對發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分的影響，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，當(dāng)含水量在25%～35%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值隨含水量的增大呈顯著增加趨勢(P＜0.05)，繼續(xù)加大含水量，發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值顯著降低(P＜0.05)，這可能是由于含水量過低，導(dǎo)致固態(tài)介質(zhì)中營養(yǎng)成分溶解度的下降及較低的基質(zhì)膨潤度，微生物生長受抑制，營養(yǎng)成分轉(zhuǎn)換率降低，而含水量過高，導(dǎo)致基質(zhì)顆粒間孔隙率的降低、黏性增加，增加了微生物菌體代謝所產(chǎn)生的CO2的傳質(zhì)阻力，抑制微生物生長發(fā)酵。故含水量選擇35%為宜。

2.2.1.4 發(fā)酵時(shí)間的影響

在粉碎長度5cm，配料比1∶10，含水量35%，發(fā)酵時(shí)間分別為25、30、35、40、45d條件下，測定發(fā)酵產(chǎn)物OD值，分析發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分的影響，結(jié)果見圖8。

由圖8可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在25～35d時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值隨發(fā)酵時(shí)間的延長而顯著上升(P＜0.05)，繼續(xù)延長發(fā)酵時(shí)間，發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值呈平緩上升趨勢(P＞0.05)，這是由于發(fā)酵過程中，產(chǎn)物營養(yǎng)成分濃度始終在變化，一般高峰生長階段時(shí)間越長，其生產(chǎn)率越高，但到一定時(shí)間后生產(chǎn)率提高緩慢。為了獲得更多的產(chǎn)物營養(yǎng)成分，時(shí)間過短，不足以獲得所需的優(yōu)質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)品;時(shí)間過長，由于環(huán)境已不利于菌體生長，往往會造成菌體消溶，同時(shí)增加生產(chǎn)成本。因此，發(fā)酵時(shí)間選擇35d為宜。

2.2.2響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.2.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用中心組合設(shè)計(jì)原理，以粉碎長度(X1)、配料比(X2)、含水量(X3)和發(fā)酵時(shí)間(X4)為響應(yīng)變量，發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平見表5，Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。

利用DesignExpert10.0.4軟件對表6實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到粉碎長度、配料比、含水量和發(fā)酵時(shí)間的二次多項(xiàng)式回歸方程:OD值=0.95-0.025X1+0.17X2+0.026X3+0.049X4+0.001X1X2+0.026X1X3+0.024X1X4-0.021X2X3+0.002X2X4-0.005X3X4-0.019X21-0.53X22-0.088X23-0.18X24。

該模型的分析結(jié)果及模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見表7。

由表7可知，二次回歸模型F值為162.210，P＜0.0001，表明模型極顯著。失擬項(xiàng)P=0.2341＞0.05，失擬項(xiàng)差異不顯著，說明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均可用此回歸模型描述，未知因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很小。模型決定系數(shù)R2=0.9939，說明99.39%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)變異性均可用此回歸模型解釋，模型可信度較高，該方程能很好地與實(shí)際情況擬合，較好地反映了發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值與粉碎長度、配料比、含水量、發(fā)132CHINAOILSANDFATS2020Vol.45No.3酵時(shí)間之間的關(guān)系，因此該回歸方程可較好預(yù)測發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值隨各參數(shù)的變化規(guī)律。校正系數(shù)R2Adj=0.9877，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果有98.77%受各因素的影響。綜上所述，該模型可用于發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值分析和預(yù)測。通過表7中F值可判斷各自變量對因變量的影響依次為X2＞X4＞X3＞X1，即配料比對發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值的影響最大(P＜0.01)，其次為發(fā)酵時(shí)間(P＜0.01)、含水量(P＜0.05)和粉碎長度(P＜0.05)。由回歸方程和方差分析可知，二次項(xiàng)中X22、X23、X24對發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值的影響達(dá)極顯著水平(P＜0.01)。

2.2.2.2 工藝條件的優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，結(jié)合回歸模型，預(yù)測發(fā)酵產(chǎn)物制備的最佳工藝條件為粉碎長度3.94cm、配料比1∶10.16、含水量35.23%、發(fā)酵時(shí)間35.50d，此條件下OD值為0.976。

2.2.2.3 模型驗(yàn)證

為了驗(yàn)證響應(yīng)面模型的可預(yù)見性，同時(shí)為了簡化實(shí)驗(yàn)操作，將發(fā)酵產(chǎn)物制備工藝的最佳發(fā)酵條件修正為粉碎長度4cm、配料比1∶10、含水量35%、發(fā)酵時(shí)間36d，該條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，OD值為0.966，RSD為1.66%，與模型預(yù)測值誤差為1.02%。經(jīng)SPSS下ANOVA分析，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)OD值與預(yù)測OD值差異不顯著(P=0.376＞0.05)。說明該模型可以有效預(yù)測發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分，優(yōu)化結(jié)果可靠，可用于指導(dǎo)啤酒酵母和乳酸菌對棕櫚粕渣飼料的發(fā)酵工藝。

2.3 成分分析

優(yōu)化條件下對基料和發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行主要成分分析，結(jié)果見表8。

 

由表8可知:棕櫚仁渣經(jīng)啤酒酵母和乳酸菌發(fā)酵后，粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣、磷、含水量分別為18.63%、17.50%、6.50%、3.86%、0.80%、0.78%、35.12%，總菌落數(shù)為7.2×1010個(gè)/g;發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣、磷、含水量分別為7.20%、7.61%、26.20%、5.20%、0.38%、0.26%、16.20%，總菌落數(shù)為9.0×107個(gè)/g。

通過發(fā)酵產(chǎn)物替代部分傳統(tǒng)粗飼料中玉米秸稈后進(jìn)行肉牛喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，肉牛健康狀況良好，飼料消化吸收利用率高，育肥效果顯著。因此，該研究可為啤酒酵母和乳酸菌應(yīng)用于棕櫚粕渣發(fā)酵飼料工業(yè)及棕櫚粕渣資源高值化利用提供理論指導(dǎo)及依據(jù)。

3結(jié)論