凝結(jié)芽孢桿菌的研究
益生菌凝結(jié)芽孢桿菌是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。凝結(jié)芽孢桿菌具有與乳酸桿菌、雙歧桿菌一樣的調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群平衡、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝和利用、提高免疫力等保健特性,凝結(jié)芽孢桿菌形成的芽孢具有耐高溫、耐酸和耐膽鹽等高抗逆性特點(diǎn)。凝結(jié)芽孢桿菌作為新型微生態(tài)制劑,在畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、醫(yī)藥、保健和食品行業(yè)被廣泛應(yīng)用。作者在此簡(jiǎn)單概述凝結(jié)芽孢桿菌的理化性質(zhì)以及在工業(yè)生產(chǎn)、養(yǎng)殖業(yè)以及臨床等方面的應(yīng)用進(jìn)展。
1凝結(jié)芽孢桿菌的理化性質(zhì)
凝結(jié)芽孢桿菌為芽孢桿菌屬革蘭氏陽(yáng)性桿菌,端生芽孢,表面無(wú)鞭毛,多數(shù)菌兩端鈍圓,少數(shù)菌為短鏈狀。凝結(jié)芽孢桿菌的最適生長(zhǎng)pH值為6.6~7.0,最適生長(zhǎng)溫度為45~50 ℃,可以分解糖類生成L-乳酸,為同型乳酸發(fā)酵菌。凝結(jié)芽孢桿菌具有產(chǎn)L-乳酸、生成芽孢、兼性厭氧、耐酸等生理生化特征,經(jīng)口服進(jìn)入到腸胃后,具有益生保健特性。產(chǎn)L-乳酸特征,使得腸道中的雙歧桿菌等利用乳酸的有益菌能更好地生長(zhǎng)與繁殖。生成芽孢特征,可以更好地恢復(fù)胃腸道的微生態(tài)平衡,且所產(chǎn)芽孢使得凝結(jié)芽孢桿菌能夠耐受胃液的低pH值環(huán)境。兼性厭氧特征,使得凝結(jié)芽孢桿菌適宜在人體消化系統(tǒng)尤其是腸道等低氧環(huán)境下生長(zhǎng)。耐酸特征,則保證了凝結(jié)芽孢桿菌有85%的概率通過(guò)胃液在腸 道存活生長(zhǎng)。但是由于凝結(jié)芽孢桿菌沒(méi)有鞭毛,導(dǎo)致其粘附性較弱,無(wú)法在腸道中長(zhǎng)期存活。凝結(jié)芽孢桿菌在腸道中還會(huì)分泌大量有益物質(zhì),如淀粉酶、蛋白酶、B族維生素、氨基酸、短鏈脂肪酸和凝固素等,這些物質(zhì)不僅有利于腸道消化吸收還能抑制有害細(xì)菌。特別是凝固素,在60℃、pH值4~8的條件下處理90min仍保持生物活性,且不受淀粉酶、酯酶和有機(jī)溶劑的影響。因此,凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)胃腸道炎癥有一定的治療作用。
凝結(jié)芽孢桿菌還具有很強(qiáng)的抗逆性,在高溫、高滲和酸性環(huán)境下均保持較高的存活率,能有效穿過(guò)胃液環(huán)境(強(qiáng)酸和消化酶),在腸道生長(zhǎng),并發(fā)揮益生作用。但在酸性環(huán)境中,凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)熱耐受性下降。
2凝結(jié)芽孢桿菌在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用
2.1 生產(chǎn)乳酸
乳酸及其衍生物作為重要的有機(jī)化工原料和精細(xì)化學(xué)品被廣泛應(yīng)用。凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸具有轉(zhuǎn)化率高、能耗少等特點(diǎn),原料價(jià)廉、來(lái)源廣,所產(chǎn)乳酸具有較高的光學(xué)純度。現(xiàn)階段國(guó)際上乳酸幾乎全部是通過(guò)微生物發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)的。目前,對(duì)芽孢桿菌屬細(xì)菌的研究主要以自然篩選和傳統(tǒng)誘變選育為主。Yadav等報(bào)道了一系列產(chǎn)乳酸菌株,其中便有凝結(jié)芽孢桿菌。康莉首先采用高錳酸鉀-溴化鉀平板法初篩出高產(chǎn)乳酸的凝結(jié)芽孢桿菌菌株,然后通過(guò)紫外-氯化鋰復(fù)合誘變進(jìn)行復(fù)篩,為了進(jìn)一步提高殘留總糖的消耗速率,在發(fā)酵過(guò)程中又采用光敏試劑8-甲氧補(bǔ)骨脂素對(duì)菌株進(jìn)行誘變處理,使得誘變后的菌株消耗麥芽二糖的能力提高了21.3%,乳酸產(chǎn)量最高達(dá)到64.8g·L-1。馬瑞通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選出凝結(jié)芽孢桿菌S44,并對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在優(yōu)化條件下,發(fā)酵72h,85g·L-1葡萄糖即消耗完畢,乳酸產(chǎn)量提高了25.2%,由優(yōu)化前的59.09g·L-1提高到73.95g·L-1,糖酸轉(zhuǎn)化率為86.75%,糖利用率為100%。謝月嬌用PEG酶水解玉米秸稈中的木質(zhì)纖維素得到葡萄糖,葡萄糖得率為81.11%,酶解率為87.01%;然 后 利 用 酶 解 上 清 液 進(jìn)行凝結(jié)芽孢桿菌 LA204發(fā)酵產(chǎn)乳酸,乳酸最終濃度為84.49g.L-1,秸稈轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.56g·g-1,基本實(shí)現(xiàn)秸稈纖維素和半纖維素的有效利用。Ong等利用凝結(jié)芽孢桿菌 WCP10-4發(fā)酵纖維二糖產(chǎn)L-乳酸,200g·L-1的纖維二糖以97.8%的轉(zhuǎn)化率和7.01g·L-1·h-1的產(chǎn)酸速率轉(zhuǎn)化成了196.3g·L-1的 L-乳酸。
2002年,盧濤等從西藏當(dāng)雄溫泉附近的土壤中篩選到一株凝結(jié)芽孢桿菌,經(jīng)紫外線和亞硝基胍誘變,獲得一株酶活達(dá)到100U.mL-1的突變菌株,較出發(fā)菌株的酶活提高了約25倍,發(fā)酵液經(jīng)90 ℃ 處理60min,相對(duì)酶活仍保持在90%以上。Badu等對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)胞外α-淀粉酶的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)有機(jī)氮 源(如蛋白胨和牛肉提取物)利于其產(chǎn)生α-淀粉酶。Medda等對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌 CUMC512所產(chǎn)淀粉酶進(jìn)行純化,比活力提高72倍,酶產(chǎn)率為49%~52%。
2.3 生產(chǎn)脂肪酶
細(xì)菌脂肪酶在生物技術(shù)工業(yè)中發(fā)揮著重要作用,如作為洗滌添加劑、催化外消旋化合物動(dòng)力學(xué)分解以及催化酯化反應(yīng)等。Kanwar等對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌 MTCC-6375的一種新型胞外脂肪酶進(jìn)行了分離純化,該酶在45℃下暴露20min依然能夠保持100%的酶活。Alkan等通過(guò)凝結(jié)芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵制備胞外脂肪酶,以甜瓜固體廢棄物為基本營(yíng)養(yǎng)源,添加1%橄欖油,培養(yǎng)24h,脂肪酶產(chǎn)量達(dá)到最高(78069U·g-1)。Gowthami等從土壤樣品中分離得到一株能夠分泌耐高溫脂肪酶的凝結(jié)芽孢桿菌,優(yōu)化培養(yǎng)條件后,脂肪酶產(chǎn)量增加3.2倍。
3討 論
近年來(lái)我國(guó)養(yǎng)豬用抗生素的弊端日益暴露,研發(fā)與推廣安全高效飼料已成為飼料工業(yè)與養(yǎng)豬業(yè)的熱點(diǎn)之一。我國(guó)農(nóng)業(yè)部已于2013年12月30日將凝結(jié)芽孢桿菌正式列入《飼料添加劑品種名錄 2013》。凝結(jié)芽孢桿菌具有乳酸桿菌、雙歧桿菌等腸道主要有益菌的相似益生功能,且具備良好的抗逆性,能夠滿足仔豬等畜禽顆粒飼料的加工需求。蒲俊寧在斷奶仔豬飼糧中添加200~400g·t-1凝結(jié)芽孢桿菌制劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn),仔豬的空腸食糜雙歧桿菌數(shù)量、盲腸食糜雙歧桿菌和芽孢桿菌數(shù)量顯著增加(P<0.05),空腸黏膜claudin-1、occludin基因表達(dá)水平明顯 提 高(P<0.05),空腸黏膜mucin2基因mRNA相對(duì)表達(dá)量也顯著提高(P<0.05),斷奶仔豬飼糧中添加苯甲酸+凝結(jié)芽孢桿菌+牛至油顯著降低了仔豬血清TNF-α和IL-1β的含量。楊玲等在仔豬飼糧中添加200mg·kg-1凝結(jié)芽孢桿菌,明顯降低了仔豬腹瀉率及仔豬糞便大腸桿菌數(shù) 量。張?jiān)?等在斷奶仔豬飼糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌,然后前腔靜脈采血,分離血漿;屠宰場(chǎng)取腸段制成切片,顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),添加凝結(jié)芽孢桿菌可改善仔豬小腸形態(tài)結(jié)構(gòu),顯著提高仔豬血液白蛋白水平,降低總膽固醇和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶水平,提高回腸和十二指腸絨毛高度,增大十二指腸絨毛表面積。李永明等研究了飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)母豬及仔豬腸道微生物組成和血清生化指標(biāo)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌有提高母豬糞微生物多樣性指數(shù)的趨勢(shì)(P=0.15),顯著提高 Anaeroplasma屬細(xì)菌含量(P<0.01),顯著降低Catenibacterium屬細(xì)菌含量 (P<0.05),有提高 Butyricicoccus(P<0.1)、Peptoniphilus(P=0.1)和Acetivibrio(P<0.1)屬細(xì)菌含量的趨勢(shì),有降低 Helicobacter(P<0.1)、Trabulsiella(P=0.05)、Lachnobacterium(P<0.1)和 Planobacterium(P=0.1)屬細(xì)菌含量的趨勢(shì);同時(shí)使母豬血清內(nèi)毒素(ET)含量顯著降低21.3%(P<0.05)、血清免疫球蛋白IgG 含量顯著提高23.3%(P<0.05)、血清觸珠蛋白(HPT)含量顯著降低50%(P<0.01)、主要急性期蛋白(MAP)含量顯著降低34.5%(P<0.05),可見(jiàn)飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌可明顯減少母豬腸源性內(nèi)毒素吸收,減少炎癥反應(yīng),增強(qiáng)免疫力,提高母豬健康水平。黃遵錫等發(fā)現(xiàn)飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑能夠顯著增加實(shí)驗(yàn)仔豬體重,顯著降低料肉比。
3.2 水產(chǎn)養(yǎng)殖
隨著科技的進(jìn)步,人民生活水平的提高,水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模逐步擴(kuò)大,從而引發(fā)養(yǎng)殖環(huán)境惡化、水產(chǎn)疾病頻發(fā)等問(wèn)題,為解決這些問(wèn)題,大量使用消毒劑和抗生素,形成了惡性循環(huán)。微生態(tài)制劑具有安全性高、無(wú)殘留的特性,有望成為治理水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的利器。凝結(jié)芽孢桿菌不僅可促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物消化吸收,降低餌料系數(shù),提高免疫和抗病能力,還可凈化養(yǎng)殖環(huán)境。付天璽等在基礎(chǔ)飼料中分別添加不同劑量的凝結(jié)芽孢桿菌均能顯著提高奧尼羅非魚(yú)的胃、肝、胰和腸道蛋白酶活性(P<0.05),實(shí)驗(yàn)組的干物質(zhì)表觀消化率、蛋白質(zhì)消化率、相對(duì)增重率、餌料系數(shù)和蛋白質(zhì)效率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。Ring等發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌能夠促進(jìn)錦鯉的生長(zhǎng),與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組錦鯉體重每尾約增加8.3g,存活率提高2.7%。張維娜采用體外抑菌實(shí)驗(yàn)和共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)考察了凝結(jié)芽孢桿菌JSSW-07對(duì)多種水產(chǎn)病原菌的拮抗作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),凝結(jié)芽孢 桿菌對(duì)溫和氣單胞菌 (Aeromonas sobria)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)具有拮抗作用,能夠抑制其生長(zhǎng),同時(shí)還能夠提高堿性磷酸酶、總蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶的水平,提高肝臟抗氧化能力,從而較好促進(jìn)銀鯽幼魚(yú)的生長(zhǎng),提高機(jī) 體 免 疫 力。王彥波研 究 發(fā) 現(xiàn),在 飼料中添加適量凝結(jié)芽孢桿菌,能夠改善羅非魚(yú)肌肉中鈣、磷和粗脂肪的含量并增強(qiáng)其生長(zhǎng)性能。趙鈺以凝結(jié)芽孢桿菌LL1103為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)粗提抑菌物質(zhì)lactocinL L1103在各濃度下均能對(duì)大黃魚(yú)起到抑制腐敗菌生長(zhǎng)、延長(zhǎng)貨架期的作用。王明陽(yáng)等發(fā)現(xiàn)添加1×1010CFU·kg-1凝結(jié)芽孢桿菌,能 顯 著 提 高對(duì)蝦血清溶菌酶、總一氧化氮合酶、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶的活性,可見(jiàn)飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌可有效促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng),提高其血清非特異性免疫水平。
國(guó)內(nèi)對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌在養(yǎng)雞方面的應(yīng)用研究還處于起步階段,相關(guān)報(bào)道不多。趙必遷等探究了凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能的影響,采用玉米-豆粕型粉狀飼糧,選取24000只315日齡的羅曼粉殼蛋雞,隨機(jī)分成3組,2個(gè)實(shí)驗(yàn)組在對(duì)照組飼糧基礎(chǔ)上分別添加150mg·kg-1和200mg·kg-1凝結(jié)芽孢桿菌,結(jié)果顯示,2個(gè)實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)蛋率 顯著提高 2.02% (P<0.05)和1.57%(P<0.05),破蛋率顯著降低17.25%(P<0.05)和 14.78%(P<0.05),死亡率顯著降低22.58%(P<0.05)和29.03%(P<0.05)。王政等考察了飲水中添加凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)白羽肉雞生產(chǎn)性能、腸道微生物數(shù)量、揮發(fā)性脂肪酸及空腸腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果表明,飲水中添加1×106cfu·mL-1的凝結(jié)芽孢桿菌能顯著提高白羽肉 雞采食量 (P<0.05),盲腸食糜中乳酸桿菌數(shù)量顯著增加(P<0.05),而大腸桿菌數(shù)量顯著降低(P<0.05),高劑量的凝結(jié)芽孢桿菌能夠顯著增加丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸的生成(P<0.05),并增加空腸絨毛高度/隱窩深度。曹廣軍等研究發(fā)現(xiàn),在商品母黃羽雞基礎(chǔ)飼糧中添加不同劑量的凝結(jié)芽孢桿菌制劑可提高日均采食量和日均增重量,顯著降低料肉比,同時(shí)提高肌肉的pH值,緩解肌肉酸解速度。Wu等研究發(fā)現(xiàn),凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)患有壞死性腸炎的肉雞有顯著療效。
凝結(jié)芽孢桿菌作為一種高耐受性的益生菌,可以順利通過(guò)人體胃腸道系統(tǒng),調(diào)節(jié)腸道菌群異常所引起的疾病,調(diào)節(jié)腸道消化功能,作為免疫佐劑提高腸道免疫力。基于凝結(jié)芽孢桿菌在宿主腸道中的調(diào)節(jié)功能,其在胃腸道疾病臨床治療上具有很好的輔助效果。李躍芝用蒙脫石散與凝結(jié)芽孢桿菌活菌片聯(lián)合沙棘干乳劑治療小兒遷延性腹瀉,效果很好。同樣的,張玉梅等用凝結(jié)芽孢桿菌活菌片與復(fù)方胃蛋白酶顆粒聯(lián)合治療小兒遷延性慢性腹瀉,5d后,以糞便性狀及次數(shù)為評(píng)判 標(biāo) 準(zhǔn),治療有效率達(dá)到95%以上,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Majeed等用凝結(jié)芽孢桿菌MTCC5856治療腹瀉型腸道易激綜合癥,與對(duì)照組的安慰劑相比,90d后服用凝結(jié)芽孢桿菌活菌片的患者臨床癥狀顯著改善。孕婦作為特殊群體,臨床用藥往往受到一定的限制。而凝結(jié)芽孢桿菌活菌片非常安全,是國(guó)家批準(zhǔn)的明確寫明孕婦和哺乳期婦女可以使用的益生菌制劑。郭偉男采用常規(guī)靜脈補(bǔ)液療法聯(lián)合凝結(jié)芽孢桿菌活菌片治療妊娠劇吐,7d治療有效率為100%,治愈率提高了近2倍,在提高總體療效、提高尿酮體轉(zhuǎn)陰率、改善患者惡心嘔吐癥狀等方面均較單純靜脈補(bǔ)液效果更好(P<0.05)。凝結(jié)芽孢桿菌與其它益生菌相比是唯一具有保水作用的益生菌制劑,可起到保水潤(rùn)腸的作用,有效消除腹脹便秘等。臨床證明,凝結(jié)芽孢桿菌在治療孕婦功能性腹脹、預(yù)防剖腹產(chǎn)術(shù)后胃腸功能紊亂等方面具有顯著的效果。凝結(jié)芽孢桿菌除了對(duì)腸道疾病有很好的臨床效果外,對(duì)一些細(xì)菌病毒等傳染類疾病也有很好的臨床應(yīng)用效果。凝結(jié)芽孢桿菌抑菌物質(zhì)對(duì)革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽(yáng)性菌均有明顯的抑菌效果,具有廣譜抗菌性。細(xì)菌性陰道病(BV)是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的陰道感染疾病,通常使用抗生素治療,但是治療效果不明顯。為了證明凝結(jié)芽孢桿菌的輔助治療可以提高抗生素療法的治愈率,Sudha等進(jìn)行了初步研究:選取40個(gè)年齡和患病程度一樣的患者,分成2組,對(duì)照 組患者只給予標(biāo)準(zhǔn)抗生素治療,實(shí)驗(yàn)組在抗生素的基礎(chǔ)上輔以凝結(jié)芽孢桿菌 UniqueIS-2膠囊,治療90d后,實(shí)驗(yàn)組80%的患者病癥減輕,胺檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示出明顯的陽(yáng)性反應(yīng),而對(duì)照組僅45%的患者病癥減輕。手足口病是一種腸道病毒傳染性疾病,多發(fā)于學(xué)齡前兒童。熱毒寧注射液聯(lián)合凝結(jié)芽孢桿菌活菌片治療手足口病具有很好的治愈率和總有效率。鄧星梅等用熱毒寧注射液聯(lián)合凝結(jié)芽孢桿菌活菌片治療手足口病,7d治療總有效率(治愈率和好轉(zhuǎn)率)為95.24%,治愈率提高了近1倍。
普通凝結(jié)芽孢桿菌的耐受性較差,為保證微生態(tài)制劑長(zhǎng)期儲(chǔ)存不易失活,制備時(shí)必須要考慮熱穩(wěn)定性、耐酸性、耐膽鹽性等一系列問(wèn)題。為了更好地發(fā)揮凝結(jié)芽孢桿菌的益生作用,有必要對(duì)其產(chǎn)孢條件進(jìn)行研究。快速大量地形成芽孢是制備凝結(jié)芽孢桿菌制劑的關(guān)鍵。Sen等采用響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行建模、優(yōu)化和分析,將凝結(jié)芽孢桿菌芽孢形成率提高至87.93%。Das等通過(guò)多變量響應(yīng)面建模和基于遺傳算法的優(yōu)化,每克生物量芽孢數(shù)量達(dá)到6×1012 個(gè)。陳秋紅等在15L自動(dòng)發(fā)酵罐中擴(kuò)大培養(yǎng)凝結(jié)芽孢桿菌,控制溶氧30%以上,培養(yǎng)20h,芽孢數(shù)量達(dá)到5.8×108 CFU·mL-1,芽孢形成率96.7%。黃曉雪等發(fā)現(xiàn),以紗布屑為固體載體對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)芽孢有促進(jìn)作用。楊立華發(fā)現(xiàn)西紅柿汁有顯著的促孢作用。戚薇等利用中空纖維超濾裝置高密度培養(yǎng)凝結(jié)芽孢桿菌TQ33,菌濃和芽孢數(shù)量分別達(dá)到1.6×1010 CFU·mL-1和1.2×1010 CFU·mL-1,是分批培養(yǎng)的21倍和37倍。另外,無(wú)機(jī)鹽在調(diào)控芽孢形成中也發(fā)揮著重要作用; Mn2+能促進(jìn)芽孢的形成。
4結(jié) 論
凝結(jié)芽孢桿菌因益生作用和高抗逆特性,已經(jīng)受到廣泛關(guān)注,開(kāi)發(fā)了越來(lái)越多的凝結(jié)芽孢桿菌保健品和制劑。相信,在不久的將來(lái),凝結(jié)芽孢桿菌保健品和藥品能夠更好地惠及人們,保障人們的健康。
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